利用微分离黑麦1R染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡ＿ＰＣＲ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用１Ｒ染色体的第二轮扩增产物、黑麦基因组ＤＮＡ、ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的１Ｒ染色体体外扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总基因组少;当以适量的黑麦基因组ＤＮＡ进行封阻时,微分离染色体的体外扩增产物成功地被重新定位在中期分裂相的一对１Ｒ染色体上,说明微分离１Ｒ染色体的ＰＣＲ扩增产物中的确包含了该染色体特异性的片段。此外,以从１Ｒ染色体微克隆文库中筛选出的一单、低拷贝序列和一高度重复序列分别为探针,染色体原位杂交检测发现,这一高度重复序列可能为端粒相关序列;而单、低拷贝序列却未检测到杂交信号。这些结果从不同侧面反映出染色体着染技术是证实微分离、微切割染色体的真实来源及筛选染色体特异性探针的有利工具。建立了可供参考的植物染色体着染实验体系,为染色体微克隆技术在植物中的进一步应用提供了便利。     

黑麦染色体的显微分离与PCR扩增

利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）一个完整细胞的１８条染色体（１４Ａ＋４Ｂ）,用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法（ｓｉｎｇｌｅｕｎｉｑｕｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ,ＳＵＰＰＣＲ）扩增,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,ＰＣＲ扩增产物与黑麦基因组ＤＮＡ同源。     

利用微分离黑麦IR染色体的体外扩增产物进行染色体着染研究

首先对显微分离出的黑麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ．Ｌ．）１Ｒ染色体进行了两轮Ｓａｕ３Ａ连接接头介导的ＰＣＲ扩增（ＬＡＰＣＲ）经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实这些染色体扩增片段来源于基因组ＤＮＡ之后,再利用ＩＲ染色体的第二轮扩增产物,黑麦基因组ＤＮＡ,ｒＤＮＡ基因为探针,与其根尖细胞中期分裂相进行染色体原位杂交,发现微分离的ＩＲ当色体体我扩增产物中包含大量的非该染色体特异性重复序列,而其信息量却较黑麦总     

黑麦1R染色体特异性PCR引物的分子证据

根据黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒａｌｅＬ．）与小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｗｕｍＬ．）ｒＲＮＡ基因间隔区序列差异,按Ｋｏｅｂｎｅｒ设计的引物序列,合成了黑麦特异引物ＮＯＲ－Ｒ１。运用该引物对不同植物材料进行ＰＣＲ扩增,观察表明,含有黑麦１Ｒ染色体的植物均扩增出黑麦的特异带,但含有其他黑麦染色体的小麦种质,普通小麦品种及其近缘物种长穗偃麦草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ（Ｈｏｓｔ）Ｂｅａｕｖ）     

黑麦1R染色体的显微分离与回收

建立了利用显微操作技术分离植物单个染色体的方法。以黑麦(Secale cereale L.)为材料,以其标准染色体组型图为依据,识别出黑麦含抗病基因的1R染色体。经显微操作,将单条1R染色体放入Ep-pendorf管中。研究表明,用α-溴奈饱和液对细胞进行预处理,可快速鉴别出黑麦1R染色体。采用去壁低渗制片技术,可明显地改善显微分离单染色体的条件。     

黑麦1R染色体的微切微克隆研究

显微分离出黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）１Ｒ染色体,用ＣｏｈｅｓｉｖｅａｄａｐｔｅｒｓｓｉｎｇｌｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ（ＣＡＳＰＰＣＲ）方法进行体外扩增,以ＤＩＧ１１ｄＵＴＰ标记扩增产物为探针,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交,结果表明扩增产物来自黑麦１Ｒ染色体。用１／１０体积的连接物转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α,获得１００００多个重组菌落。经酶切分析,克隆子的插入片段为２５０～５００ｂｐ,为进一步筛选１Ｒ染色体的分子标记打下了基础     

黑麦基因组中不同染色体在缺磷胁迫下对普通小麦根系分泌酸性磷酸酯酶(Acph)遗传效应的研究

以一整套中国春－帝国黑麦二体附加系为材料,通过在低磷胁迫下对其根系分泌Ａｃｐｈ 能力测定及同工酶等电聚焦分析证明：缺磷胁迫是Ａｃｐｈ基因表达的诱导因子,帝国黑麦不同染色体在中国春小麦背景中对其根系在低磷胁迫下 Ａｃｐｈ的分泌具不同的正效应,其中以 １Ｒ 染色体的效应最为强烈, Ａｃｐｈ等电聚焦（ＩＥＦ）的酶谱清楚地表明黑麦的１Ｒ染色体上携有在缺磷胁迫下诱导表达的Ａｃｐｈ基因。     

黑麦B染色体端粒相关序列的克隆

利用显微切割技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌＬ．）１０个Ｂ染色体短臂端部片段,并利用寡核苷酸引物（ＣＣＣＴＡＡＡ）３及新建立的二级单引物序列ＰＣＲ扩增法,扩增了黑麦Ｂ染色体端粒相关序列。染色体原位杂交实验将ＰＣＲ产物定位于Ｂ染色体短臂末端,多数Ａ染色体末端也显示清晰的杂交信号。部分ＰＣＲ产物克隆到ｐＵＣ１９载体中,对其中一个克隆子ｐｐ３的序列分析结果表明,它与玉米亚端部克隆子ｐＢＦ２６６部分区域的同源性为９２％。就目前资料检索,黑麦、玉米端粒相关序列具有高度同源性还未见报道。对这一实验设计在构建高密度ＲＦＬＰ图谱中的应用进行了探讨     

黑麦基因组中不同染色体在缺磷胁迫下对普通小麦根系分泌酸性磷酸 …

以一整套中国春－帝国黑麦二体附加系为材料，通过在低磷胁迫下对其根系分泌Ａｃｐｈ能力测定及同工酶等电聚焦分析证明：缺磷胁迫是Ａｃｐｈ基因表达的诱导因子，帝国黑麦不同染色体的中国春小麦背景中对其根系在低磷胁迫下Ａｃｐｈ的分泌具不同的正效应，其中以１Ｒ染色体的效应最为强烈，Ａｃｐｈ等电聚焦（ＩＥＦ）的酶谱清楚地表明黑麦的１Ｒ染色体上携有在缺磷胁迫下诱导表达的Ａｃｐｈ基因。     

组织培养诱导的普通小麦─黑麦代换系和附加系分子细胞遗传学检测

通过组织培养从普通小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）与八倍体小黑麦（×ＴｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅＷｉｔｍａｃｋ）杂种Ｆ０幼胚再生植株后代中获得２个代换系９３０４９８、９３０４８３和１个附加系９３００２９。以黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）基因组ＤＮＡ为探针,采用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）证实了黑麦染色体的存在。在有丝分裂中期,经ＦＩＳＨ处理的黑麦染色体为黄绿色,明显区别于红色的小麦染色体。染色体配对、Ｃ分带、麦谷蛋白电泳分析,证明两个代换系为１Ｄ／１Ｒ代换,附加的也是黑麦１Ｒ染色体     

黑麦染色体组有效利用土壤潜在磷基因的遗传分析

以一整套中国春－帝国黑麦二体异附加系为材料用土培盆栽法对黑麦染色体组有效利用土壤潜在磷基因的遗传分析表明,附加帝国黑麦不同染色体对中国春小麦有效利用土壤潜在磷特性具有不同的效应。黑麦１Ｒ、７Ｒ染色体上携带有对该特性有较强促进作用的基因。而５Ｒ染色体上则携带有对该特性具强烈抑制效应的基因     

巨穗小麦种质C—分带特征分析

对５个不同类型巨穗小麦种质材料进行Ｃ－分带分析,发现均有一对特征染色体存在,初步确定这对染色体为小麦－黑麦１ＢＬ／１ＲＳ易位染色体。     

应用荧光原位杂交和RFLP标记检测多小穗小麦新种质10-A中的黑麦染色质

利用ＡＰＡＧＥ、荧光原位杂交技术和ＲＦＬＰ标记,对导入黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）多小穗等性状创制的小麦新种质１０＿Ａ进行了分子标记检测。ＡＰＡＧＥ分析发现,１０＿Ａ与其他１ＲＳ／１ＢＬ易位系一样,含有１ＲＳ的醇溶蛋白标记位点Ｇｌｄ１Ｂ３。以黑麦基因组总ＤＮＡ作探针,用中国春（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍｃｖ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ）基因组ＤＮＡ作封阻,与１０＿Ａ根尖细胞有丝分裂染色体进行荧光原位杂交。结果表明,黑麦的１ＲＳ易位到１０＿Ａ中。用２５个ＲＦＬＰ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,进一步发现１０＿Ａ的１ＢＳ特异限制性片段发生丢失,代之以黑麦１ＲＳ的特异限制性片段,而位于其他染色体上的特异限制性片段未发生缺失。据此认为,多小穗小麦新种质１０＿Ａ属于１ＲＳ／１ＢＬ易位系。同时还讨论了１０＿Ａ在小麦遗传改良中的利用情况。     

应用荧光原位杂交和RFLP标记检测多小穗小麦新种质10—A中的黑麦染 …

利用ＡＰＡＧＥ,荧光原位杂交技术和ＲＦＬＰ标记,对导入黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）多小穗等性状创制的小麦新种质１０－Ａ进行了分子标记检测,ＡＰＡＧＥ分析发现,１０－Ａ与其他１ＲＳ／１ＢＬ易位系一样,含有１ＲＳ的醇溶蛋白标记位点Ｇｌｄ１Ｂ３。以黑麦基因组总ＤＮＡ作探针,用中国春（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍｃｖ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ）基因组ＤＮＡ作封阻,与１０－Ａ根尖细胞有丝分裂染     

小麦染色体的显微激光分离

探讨了应用氩离子激光进行植物染色体显微激光切割,分离的可行性,应用该技术对普通小麦的体细胞及特定染色体（１Ｂ染色体）实施切割,分离,并且以分离到的单细胞核或单条染色体为模板进行了ＰＣＲ ＤＮＡ扩增。该技术比玻璃针切割分离染色体技术,具有操作方便,容易掌握,且可对整个细胞核进行分离等优点,有利于促进染色体显微操作技术的普及应用。同时,探讨了染色体显微操作技术在细胞遗传学及分子生物学研究领域的应用前景     

簇毛麦低拷贝cDNA序列的克隆和鉴定

从簇毛麦叶片中提取总ＲＮＡ,进一步分离ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板反转录合成ｃＤＮＡ,两端经Ｔ４ＤＮＡ多聚酶修平后加ＥｃｏＲ１接头分子,连接于质粒ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）的ＥｃｏＲ１克隆位点,转化大肠杆菌ＪＭ１０３菌株建立了ｃＤＮＡ文库。用ＰＣＲ扩增重组质粒的ｃＤＮＡ插入序列,用＾３２Ｐ标记后分别与ＨｉｎｄⅢ或ＸｂａⅠ酶切的小麦－黑麦附加系ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交。根据其杂交结果,目前已鉴定出４     

急性早幼粒细胞白血病（APL）中t（15;17）染色体易位的分子机制研究

对急性早幼粒细胞白血病中ｔ（１５;１７）染色体易位的分子生物学研究显示,１７号染色体上的维甲酸受体α（ＲＡＲＡ）基因与１５号染色体上的ＰＭＬ基因并置,并产生ＰＭＬ－ＲＡＲＡ融合基因。我们以前的工作证明ＡＰＬ患者中ＰＭＬ基因断裂点集中于２个限区域,即ＰＭＬ－ｂｃｒ１和ＰＭＬ－ｂｃｒ ２,二者相距约１０ｋｂ。本文确定了ＰＭＬ－ｂｃｒ １的ＤＮＡ顺序,并确定了一例ＡＰＬ患者染色体相互易位接合部的基本结构     

小麦细胞分裂间期外源染色质的检测

以野生种基因组ＤＮＡ为探针，用荧光原位杂交研究了间期细胞核里黑麦，中间偃麦草，燕麦和簇毛染色体在普通小麦背景下的行为，易位的黑麦１ＲＳ染色体襞在间期表现为不连续的线状杂交信号贯穿细胞核，代换和附加的１Ｒ染色体在间期却呈现点状杂交信号，通过易位进入小麦的中间偃麦草和燕麦染色体片段也是点状。     

水稻双子房突变体中类copia逆转座子同源序列的研究

以水稻双子房突变体的总ＤＮＡ为模板,用简并引物扩增类ｃｏｐｉａ逆转座子的逆转录酶区域。从ＰＣＲ产物中分离到代表３个不同的类ｃｏｐｉａ逆转座子的片段,其中两个在水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）品种“窄叶青８号”和“京系１７”间产生的多态性杂交带分别定位于水稻７条染色体的９个位点。Ｒ３３－８含大量的终止码,Ｒ３３－１及Ｒ３３－４为连续的编码区,推测的氨基酸序列含８１个氨基酸残基。Ｒ３３－１的拷贝     

三个小黑麦花粉株系的染色体组成分析与抗白粉病鉴定

对来自小黑麦与小麦杂种的３个花粉株系,ＤＨ２２０－４,ＤＨ２２０－５和ＤＨ２２０－１４进行了形态性状观察,染色体组成分析和抗白粉病鉴定。经过染色体形态和数目观察、原位杂交、Ｃ－分带、同工酶等电聚焦和贮藏蛋白的ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,证明其中两个株系,ＤＨ２２０－４和ＤＨ２２０－５是６Ｒ／６Ｄ代换系,另一个株系ＤＨ２２０－１４是１Ｒ／１Ｄ代换系。经人工接种鉴定,两个６Ｒ／６Ｄ代换系高抗白粉病。从而进一步证明黑麦的６Ｒ染色体上存在抗白粉病的基因。同时还对小麦遗传背景下异源染色体的识别及６Ｒ染色体的利用价值等问题进行了讨论。