一种简单有效的基于阳离子交换层析的重组腺相关病毒纯化方法

本研究旨在探索出一套简单有效的重组腺相关病毒(rAAV)纯化方法,为基因治疗提供有力载体,推进rAAV的基因治疗走进临床.我们选用国际通用的无辅助病毒包装体系,将pAAV-cTnT-eGFP,pAAV-R2C9和pHelper三种质粒共转染HEK293T细胞系进行病毒包装,并通过荧光显微镜观察包装效率;应用阳离子交换层析法对收获处理后的病毒液进行纯化,包括第Ⅰ轮高pH下的除杂纯化和第Ⅱ轮以严格密集梯度洗脱为特点的进一步纯化.通过SDS-PAGE和Western Blot(WB)对纯化产物进行检测,使用Q-PCR法测定病毒滴度,最后再通过透射电镜对病毒颗粒进一步验证和分析.荧光显微镜结果显示,病毒包装效率较高,可达70％～80％;SDS-PAGE结果表明病毒纯化效果显著,第Ⅰ轮纯化除去了大量的蛋白杂质,第Ⅱ轮纯化也明显除去部分杂质;WB和电镜结果证明,纯化产物实为rAAV病毒,经Q-PCR测得病毒的滴度可达2.15X1012GC/mL,而且电镜进一步观察到我们纯化的终成品病毒中空颗粒含量极少,包含基因的实心颗粒占比可达99％.本研究成功开发出了一套的简单方便、切实有效的rAAV纯化方法,并且该方法能有效去除空壳病毒,提高包含基因的实心病毒占比.     

猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性

从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。     

发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究

为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测。浓缩纯化的SFTSV灭活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度。然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新西兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果。结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP。浓缩后的纯化病毒纯度达90%以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态。纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组。本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索。     

大光金鱼花不同叶位叶片超微弱发光的光子计数统计

采用生物超微弱发光探测技术,并用量子光学中的光子计数分布统计方法测量植物叶片超微弱发光的结果表明,大光金鱼花幼叶和老叶的超微弱发光强度较低,光子计数分布与泊松分布基本吻合。     

用蚀斑法滴定痘苗病毒的准确性及其精确数学模型的探讨

用蚀斑法滴定病毒是确定感染病毒颗粒存在数量的一种较准确方法。本实验表明,痘苗病毒吸附4h后仍有大量病毒粒子未能吸附到细胞单层,进而测定出病毒接种量、维持液加量和所测病毒滴度间具有一种互为消长的非线性相关性。因而设计了几种检测方法,其准确性均优于常规痘苗病毒蚀斑测定法。利用装配有Mathematic软件包的计算机在痘苗病毒接种量、维持液加量和所测病毒滴度间建立了曲线拟合模型和曲面拟合模型。通过曲线拟合模型推断病毒感染滴度为常规法滴定值的近5倍。     

基于零模型的宁夏荒漠草原优势种群点格局分析

植物种群空间分布格局是多种生态过程综合作用的结果。明确植物优势种群个体的空间分布格局与形成机制有助于认识种群生态适应对策与群落多样性维持机制。以宁夏荒漠草原优势种群蒙古冰草、短花针茅、牛枝子和牛心朴子为研究对象,采用完全空间随机零模型分析其种群空间分布格局特征,并通过异质泊松零模型与泊松聚块零模型探讨生境异质性、扩散限制等因子在其空间分布格局形成过程中的作用。结果显示:(1)完全空间随机零模型下,4个物种在4 m尺度范围内表现为聚集分布,随尺度增大,逐渐过渡到随机分布和均匀分布。(2)在排除生境异质性的异质泊松零模型下,蒙古冰草种群在整个研究尺度上表现为随机分布;牛枝子、短花针茅和牛心朴子种群仅分别在0—0.2、0.1—0.4 m与0—0.2 m尺度范围内发生偏离,表现为均匀分布与聚集分布,其他尺度均为随机分布。(3)在排除扩散限制的泊松聚块零模型下,所研究种群均表现为随机分布。综上,荒漠草原优势种群在小尺度范围内主要表现为聚集分布;生境异质性与扩散限制均是驱动其空间分布格局形成的重要因子,相对而言,小尺度空间范围内扩散限制的作用更为显著。     

细胞工厂培养轮状病毒基因重配株Ls(G3型)条件的优化研究

目的以细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株Ls的可行性研究。方法采用细胞工厂与相应的转瓶培养工艺作对比,比较两种容器内细胞生长状态与病毒收获液滴度,并对细胞工厂培养条件进行了优化。结果以相同浓度接种细胞时,细胞工厂4 d长成单层,转瓶却需要7 d,经细胞仪计数后单位面积内细胞密度相当;以相同MOI接种病毒后,转瓶内的病毒于第7天病毒滴度达到峰值,细胞已完全脱落;细胞工厂于第3天病毒滴度达到峰值,并实现了3次收获。细胞工厂每次收获的病毒液滴度都稳定在一定范围,与转瓶相当。另外,细胞工厂培养条件优化结果表明,Vero细胞最佳接种浓度为3.0×104细胞/cm2,接种病毒的最适MOI为0.02~0.04。结论使用细胞工厂培养Ls株病毒不仅提高了效率,而且减少了培养空间,可替代转瓶规模化生产轮状病毒疫苗。     

Sindbis病毒蚀斑方法的建立及其在血液制品病毒灭活实验？…

实验建立了Ｓｉｎｄｂｉｓ病毒在ＢＨＫ－２１细胞内蚀斑形成的方法，Ｓｉｎｄｂｉｓ病毒接种于ＢＨＫ－２１细胞内，３天半染色，结果显示蚀斑清晰可见，直径为２－４ｍｍ，病毒滴度已达高峰期，同时将此方法用于血液制品病毒灭活实验中，结果表明该方法准确、客观，Ｓｉｎｄｂｉｓ病毒在Ｓ／Ｄ低ｐＨ孵放法等灭活病毒实验中作为有脂质包膜类病毒的指示病毒具有相对稳定性，较为适宜并且能客观的体现出各种灭活方法灭活病毒的作用。     

乙醇对病毒的作用

<正>在从人血浆分离的蛋白情况看,乙醇对病毒的两种作用应该明确地区分开来: (1)自从Cohn和他的同事们开创性的工作以来,乙醇沉淀法一直用作血浆蛋白的纯化方法。蛋白的相位分离必然把病毒分开,这种分开可能有利也可能不利。依在特殊的蛋白分离物中病毒滴度是减少抑或浓缩而定。     

腺相关病毒载体工程毒株精细化纯化

[背景] 大量制备高纯度的重组腺相关病毒（Recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV）,是以腺相关病毒（AAV）为投递载体的基因靶向治疗或基因工程药物研发过程中需要解决的重要问题。[目的] 利用层析柱法大量纯化质粒和rAAV细胞培养液,以获得高纯度的rAAV颗粒。[方法] 对组装rAAV的3种质粒用HiPrep^TM10 Sepharose 6FF和HiTrap PlasmidSelect Xtra凝胶层析柱纯化,目的是得到组装AAV的超螺旋质粒DNA,然后对组装rAAV过程中的AAV-293细胞培养方法进行优化,组装成功病毒后,再对收集到的细胞提取液用HiLoad^TM10Q和HiLoad^TM10SP阴阳离子交换层析柱纯化,最后用纯化浓缩后的rAAV感染HT1080细胞,通过流式细胞仪检测荧光表达细胞数,计算浓缩后活病毒感染滴度。[结果] HiPrep和HiTrap层析柱纯化后得到大量高纯度的超螺旋质粒DNA,组装病毒后,用HiLoad柱纯化获得大量高纯度的rAAV颗粒,通过测定,rAAV基因组滴度达到（2.46±0.37）×10¹² TCID₅₀/mL （MOI=1.0×10⁴）。[结论] 通过一系列精细化组装纯化制备出高纯度、高滴度rAAV病毒颗粒。     

以重组人巨细胞病毒pp65制备的多克隆抗体建立检测感染性病毒颗粒方法

人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染是造成器官移植失败的重要原因。建立灵敏、特异的检测方法可为及早发现感染、及时给予抗病毒治疗提供依据。以离子交换和分子筛方法纯化重组表达的HCMVpp65(rp65hp)抗原,经两步纯化后,rp65hp纯度达到95%。免疫家兔制备的抗血清,ELISA抗体滴度高达1∶2560000;免疫印迹证明能与HCMVpp65抗原特异反应。将HCMV病毒感染细胞,以纯化的多克隆抗体建立了间接免疫荧光法,成功地检测到细胞中的病毒。因此,该方法为临床检测HCMV病毒活动性感染奠定了良好的基础。     

呼吸道合胞病毒Long株的培养及应用

建立可稳定收获高滴度RSVLong株病毒的培养方法 ,所获得的RSVLong株病毒液用于RSV抗体ELISA检测。RSVLong株病毒 33℃传至 4代后 ,病毒滴度升高 ,出现典型的细胞病变。以RSVLong株病毒液作抗原所建立的ELISA试剂盒能检测出RSV特异性抗体。     

六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究

初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔。通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度。此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度。通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求。ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应。SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应。本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础。     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

细胞工厂在轮状病毒基因重配株LD9培养中的应用初探

为了探索用细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株LD9及收获高滴度的LD9病毒原液和提高产量的可行性,分别在2层4、层细胞工厂和3L1、5L转瓶培养Vero细胞,比较两种容器内细胞的生长状态。结果显示,以相同活细胞数2.5×104/ml同时接种两种不同培养容器时,细胞工厂培养3d已长成单层,而转瓶培养需5d;对两种容器长满单层时的细胞经胰酶消化后通过细胞仪计数、分析,结果显示,两种容器培养细胞长成单层时的单位面积细胞密度相当;对长成致密单层细胞的两种容器以相同的MOI(MOI=0.1)接种LD9病毒,转瓶培养的病毒于第8d病毒滴度达到高峰,为6.0～6.5 lgCCID50/ml;细胞工厂第5d病毒滴度达高峰,为6.5 lgCCID50/ml,并于第9d病毒滴度再次达到峰值,为6.0～6.5 lgCCID50/ml,实现二次收获病毒。     

混合感染的多种亚型禽流感病毒的纯化与鉴定

【目的】研究混合感染的多种亚型禽流感病毒的纯化和鉴定方法。【方法】用鸡胚终点稀释法和鸡胚终点稀释法结合特异性血清中和法分别对2-3种已知亚型禽流感病毒的混合感染样品进行纯化,并对纯化结果用RT-PCR和血凝抑制试验进行鉴定。用建立的方法对214份禽流感病毒阳性样品进行了纯化和鉴定。【结果】用鸡胚终点稀释法对样品稀释、传代6-7次可使病毒达到纯化,但用鸡胚终点稀释法结合特异性血清中和法对样品稀释、传代4-5次即可达到病毒纯化。用RT-PCR和血凝抑制试验两种方法同时鉴定病毒的纯化效果,可明显提高准确性。用本方法从214份样品中纯化出涵盖13种亚型的禽流感病毒233株。【结论】鸡胚终点稀释法及其结合特异性血清中和法均能对禽流感病毒进行纯化,但是鸡胚终点稀释法结合特异性血清中和法更具有针对性,也更有效。另外,对纯化结果的鉴定需采取多种手段。     

标记抗体染色病毒空斑计数技术的研究

用细胞病变阳性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ＋ ）病毒马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ, ＭＤＶ）血清１,２,３ 型以及细胞病变阴性（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ,ＣＰＥ－ ）病毒猪瘟病毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）强毒与弱毒和鸡新城疫病毒（Ｎｅｗ ｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ． ＮＤＶ）Ｌａｓｏｔａ 毒株及其对应的异硫氢酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的特异抗体为试验材料,以免疫荧光抗体技术（ＦＡ）为基础、并加以改进,建立了标记抗体染色病毒空斑计数技术． 该技术不仅能克服常规病毒空斑计数技术不能计数细胞病变阴性病毒和一种样品含有两种或两种以上病毒的各自空斑数的缺点,能迅速准确计数出ＣＰＥ－ 病毒和多病毒样品中病毒各自空斑数及其空斑总数,具较高敏感性、良好的可重复性．     

海洋病毒荧光显微计数法的优化与应用

【目的】建立一种快速、稳定、可靠的海洋病毒计数方法。【方法】海水水样经福尔马林固定后,滤过孔径为0.02μm的Anodisc Al2O3膜。滤膜经SYBR Green I染色后,在相应波长的激发光下进行观察。借助荧光显微镜目镜网格尺,计数视野中的病毒颗粒,换算后获得样品中病毒的浓度。【结果】对具体实验方法进行了优化,可快速、稳定地对海水中的病毒计数。【结论】建立了一种适用于国内实验条件的、可靠的海洋病毒计数方法。     

流行性乙型脑炎猪肾组织培养疫苗的研究 Ⅰ.病毒的培养和疫苗的制备

为了改进流行性乙型脑炎疫苗的质量,在国内曾进行了乙醚提纯脑炎疫苗,白陶土和硫酸铵提纯病毒及疫苗以及鸡胚组织培养疫苗的研究。我系曾证明以流行性乙型脑炎病毒感染猪后能引起毒血症,其病毒滴度可达10-3.5。因此,在1958年我们开始用猪肾单层细胞来培养流行性乙型脑炎病毒,并进行了猪肾组织培养疫苗的研究。应用这种方法有可能制备出一种安全。     

第三代慢病毒高效率包装系统的建立

慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键.本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48～72 h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法(LaSRT)测定病毒滴度.结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×108IU/mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础.