三种酵母启动子在毕赤酵母中的功能比较

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子功能的强弱对于目的基因的表达非常重要.为找到一个启动转录功能较好的启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,在毕赤酵母中研究不同启动子对外源蛋白表达的影响.首先采用PCR扩增的方法克隆了酿酒酵母甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子pScgpd,借助于载体pPIC9K和p...     

一个棉花生殖器官优势表达基因的启动子功能分析

用棉花生殖器官优势表达启动子替代CaMV35S启动子是解决目前转基因抗虫棉存在“前期抗虫性强, 后期抗虫性弱”这一生产实践问题的关键. 运用反向PCR技术从陆地棉中分离到一个棉花生殖器官优势表达基因——腺苷酸核糖基化作用因子1 (Arf1)基因的启动子序列. 该启动子具有独特的结构特征, 不仅同时包含有转录起始子(initiator), TATA box, CAAT box和GC box这四种特异元件, 而且还包含有一个5′非翻译区的内含子. 通过构建四个启动子缺失突变体, 定向替换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子, 并与GUS基因融合, 构建了4个植物表达载体. 用花粉管通道技术将它们导入到棉花中, 转基因棉花后代的GUS染色和荧光定量分析结果表明: Arf1启动子是一个典型的棉花生殖器官优势表达启动子, 它为棉花生殖器官性状的分子设计和抗虫棉的再创新提供了有用的工具.     

水稻胚乳特异性启动子的克隆及序列分析

目的:克隆获得水稻胚乳特异表达启动子pGluB-1。方法:采用PCR方法从水稻"台粳9号"基因组DNA中扩增出pGluB-1启动子序列,并克隆至pMD20-T载体上,酶切鉴定后进行测序并对测序结果进行生物信息学分析。结果:获得大小为1 353bp的pGluB-1启动子序列,该序列与已报道序列的同源性为97%。启动子功能预测及顺式作用元件分析表晨所克隆的启动子序列含有ACGT基序、AACA基序、GCN4基序和醇溶蛋白框等胚乳特异表达必需的调控元件,其序列差异可能是由于不同品种个体差异及多态性的影响。结论:成功克隆出pGluB-1启动子,为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异性表达奠定了实验基础。     

棉花Lea蛋白D-113基因启动子的克隆及序列分析

为研究植物Lea(late embryogenesis abundant）蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,通过PCR扩增,从棉花（Gossypium hirsutum cv.Coker312）中克隆了Lea蛋白基因家庭中D-113基因上游1024bp的调控序列。DNA序列分析结果表明,该片段与已报道的Lea蛋白基因同一家庭该基因的对应序列同源性达90%以上。将将启动子序列与GUS基因融合,构建成表达载体后,通过基因抢轰击导入到经ABA诱导处理的棉花胚性愈伤组织和油菜种子以及棉花的根、茎、叶中,组织化学分析结果表明,D-113基因启动子在胚中特异性表达。     

酿酒酵母gpd1和hor2基因在大肠杆菌中的共表达

利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克隆3_磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3_磷酸甘油酯酶基因(hor2 ) ,并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE_gpd1_hor2 ,将重组质粒导入大肠杆菌BL2 1菌株中,构建得到的重组菌株GxB_gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB_gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为4 6 6 7g L ,葡萄糖的转化率为4 2 87%。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3_丙二醇的工程菌打下了良好的基础。     

热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kanr)连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。     

与人PC-1同源的鼠PC-1基因的启动子的分子克隆和特性分析

为了鉴定鼠mPC-1基因表达的调控元件,克隆并分析了该基因的启动子.构建了一系列mPC-1基因启动子的截短序列.通过荧光素酶报道基因,分析了它们在前列腺癌细胞和其它细胞中的表达.结果表明,在AR阳性细胞系中,mPC-1基因启动子活性远远高于SV40和p61-PSA 启动子,mPC-1基因启动子 599 bp 至449bp 可能含有一个负调控元件; mPC-1 1.1 kb 启动子控制的表达主要在前列腺癌细胞系中; 雄激素可调控mPC-1 1.1kb 启动子表达.mPC-1 1.1kb 序列是一个有前列腺癌细胞特异性和较强的启动子,经过进一步的修饰有可能作为一种有用的前列腺癌基因治疗元件.     

酿酒酵母gpd1和hor2基因在大肠杆菌中的共表达

利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)克隆3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3-磷酸甘油酯酶基因(hor2),并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE-gpd1-hor2,将重组质粒导入大肠杆菌BL21菌株中,构建得到的重组菌株GxB-gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB-gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为46．67g／L,葡萄糖的转化率为42.87％。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3-丙二醇的工程菌打下了良好的基础。     

一种启动子克隆的改良Adaptor-PCR方法及在橡胶树上的应用实例

真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现基因的转录调控,而启动子区域含有多种顺式元件,作为基因表达调控网络的枢纽控制着基因转录的起始与效率,一直是基因表达调控研究的重点[1]。本文提供了一种改良的基于Adaptor-PCR启动子克隆方法,改进了接头序列,设计了适合两步法PCR的接头引物。选取了25种限制性内切酶对橡胶树基因组DNA进行酶切,在所有酶切产物都平端化后,与改进的接头连接,成功构建了以Adaptor-PCR为基础的橡胶树基因启动子克隆文库,并利用此文库成功克隆了橡胶树6个蔗糖转运蛋白基因、1个转化酶基因和1个海藻糖合酶基因的启动子。本文研究结果为橡胶树基因启动子克隆提供了一个高效平台,也为其他生物基因启动子克隆提供了有益的参考。     

大肠杆菌抗铜启动子的亚克隆

大肠杆菌的抗铜质粒中含有两个抗铜启动子,PpcoA和PpcoE,它们均含有copperbox。为了证实copper box在抗铜作用中的重要性以及研究抗铜启动子的特性,以质粒pUCD615为报告载体进行了这两个启动子不同长度片段的亚克隆。限制性酶切和DNA序列分析的结果表明,这些片段的亚克隆都是成功的;此外报告基因lux-荧光酶活性测定的结果表明,两个不含有copper box的Ppco short-lux亚克隆均不表达荧光酶活性,而其他启动子片段的亚克隆则都具有较高的酶活性,说明这两个亚克隆不具有启动子功能,初步证明在抗铜启动子中copper box是不可少的。     

魔芋AaHSFB1基因及其启动子的克隆与功能分析

为了初步探究魔芋热激转录因子HSFB1基因及其启动子的功能,以白魔芋Amorphophallus albus为试材,利用同源克隆方法获得长度为1 365 bp的AaHSFB1基因序列。qRT-PCR结果表明：AaHSFB1基因对热胁迫较敏感,在根中的表达量表现出先升后降的趋势,并在热处理1 h时表达丰度最高;在热处理12 h时,叶片中的表达量也达到最高,在整个热处理时段内球茎中的表达量变化不大;亚细胞定位结果显示AaHSFB1定位于细胞核内。再利用FPNI-PCR法通过三轮步移扩增得到1 509 bp的AaHSFB1启动子序列。生物信息学分析表明：AaHSFB1含有热胁迫响应元件HSE及多种与植物发育及逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析AaHSFB1启动子的功能,构建融合表达载体prAaHSFB1::GUS,利用农杆菌介导法转入拟南芥,热处理后对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果显示其表达部位主要在叶中。因此推测AaHSFB1可能在白魔芋抗外界逆境特别是热胁迫中起重要作用。     

棉纤维蔗糖合酶基因SS3上游调控序列的克隆及其表达分析

棉纤维蔗糖合酶基因SS3在棉纤维发育过程中起着重要作用.采用YADE技术克隆了该基因5′上游1717bp的调控区,该调控区含有典型的启动子核心元件TATA box ,以及TATC box、G box、GCN4 -motif、Prolamin box、Skn 1 likemotif、TCA element、HSE和O2 site等各种顺式调控元件和其他一些反应元件.将此序列和报告基因GUS融合在烟草、棉花中表达.组织化学分析结果显示棉花SuSyR序列启动GUS基因在烟草的子房、胎座、种子以及在棉花花蕾与棉铃中表达.在棉花花蕾蕾长为3mm、6mm、9mm和15mm花蕾中表达主要存在于雄蕊及雄蕊管、胎座等器官;在棉铃中,1DPA棉铃的花柱、花药、子房及胚珠中出现了蓝色,6DPA棉铃的子房及胚珠被染成蓝色,在2 0DPA的棉铃中蓝色只出现在胚珠及其纤维中、在胚珠中只有珠心被染成蓝色,在4 0DPA胚珠中只有纤维呈蓝色.研究结果揭示,棉花的SuSyR调控序列启动GUS基因主要在子房、胚珠和纤维等器官和主叶脉、茎微管束等输导组织中表达,在棉花中尤为明显,表明棉纤维蔗糖合酶基因SS3除参与棉花蕾铃发育、纤维素的合成外,还参与了光合产物的运输与分配过程.     

Construction of Stress Responsive Synthetic Promoters and Analysis of Their Activity in Transgenic Arabidopsis thaliana

To obtain strong inducible promoters to drive abiotic stress-inducible transgene expression with minimal negative effects, we constructed three artificial synthetic promoters (EKCM, EKCRM, and ECCRM) comprising multiple cis-acting stress-response elements. Each promoter was fused independently to the β-glucuronidase (GUS) reporter gene, and GUS expression was analyzed in stable expression systems in Arabidopsis thaliana. T2 transgenic progenies showed integration of the promoter-GUS construct in their genome. RT-PCR assays and histochemical staining analysis showed that GUS expression driven by each promoter increased under desiccation, cold, and high salt conditions. The activity of synthetic promoters, assessed by fluorometric quantitative analysis of GUS enzyme activity, was significantly higher than that of the rd29A promoter under various stress treatments. The most powerful promoter, EKCM, allowed about 1.29-fold in GUS activity relative to the rd29A promoter, on average, under dehydration conditions. All three synthetic promoters could drive stress-inducible GUS expression in different organs of transgenic Arabidopsis. These synthetic promoters represent valuable tools for improving the stress tolerance of crops.     

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

为克服组成型启动子启动外源基因过量表达引起的诸多问题,同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因（ABA3）的启动子(ABA3s)序列,并用PlantCARE软件分析其非生物逆境应答元件, 实时定量PCR检测ABA3基因在非生物逆境诱导下的差异表达后。然后,用该启动子构建启动GUS（β-glucuronidase）基因的表达载体, 基因枪法转化玉米愈伤组织。经组织化学染色法检测其表达后, 在高渗、高盐、低温胁迫处理及ABA诱导下检测GUS酶荧光值与荧光素酶(内参)发光值的比值(GUS/LUC), 以此评价ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性。结果表明, ABA3基因在模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫及ABA、乙稀诱导下差异表达, 说明该基因的启动子(ABA3s)具有非生物逆境诱导活性。序列分析表明, ABA3s启动子全长777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多种非生物逆境胁迫应答元件。用ABA3s启动GUS基因构建的表达载体转化的玉米愈伤组织, 响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫, 及ABA和乙稀诱导, GUS检测呈阳性。在8%甘露醇高渗条件下, GUS/LUC比值比空白对照高6倍。上述结果表明, ABA3s启动子具有非生物逆境诱导特性, 经进一步验证其功能后, 可用于玉米抗逆转基因研究。     

毛白杨PtSEP2基因启动子克隆和瞬时表达特性分析

利用PCR技术从毛白杨基因组DNA中扩增获得花器官发育相关的SEPALLATA2类似基因PtSEP25′侧翼约2.3kb的一段序列,经PlantCARE序列分析表明,该序列中含有启动子特征的保守序列及多种光应答元件,初步推测其为PtSEP2基因启动子.进一步以GUS为报告基因,构建了pPtSEP2 promoter::...     

白桦CESA7基因启动子的克隆与表达分析

克隆得到了一个白桦纤维素合成酶基因（CESA7）GenBanK登录号（EU591531）启动子序列,通过序列分析发现该启动子含有多个不同功能的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、叶片形态发育元件等,推测该启动子在白桦生长发育过程中具有关键作用。将BpCESA7启动子克隆至带有GUS报告基因的植物表达载体,命名为proBpCESA7-121-GUS,并利用农杆菌介导方法侵染白桦和拟南芥,然后通过GUS组织化学染色观察BpCESA7基因启动子的组织表达特性。结果在白桦的根、茎、叶和拟南芥的根,叶,萼片、雌蕊中检测到了GUS活性,说明BpCESA7基因启动子具有启动子活性,并且在白桦的根和叶中染色最深,表明BpCESA7基因在白桦根和叶中表达量较高,并且其存在组织表达特异性。