棉花LIM结构域基因(GhLIM1)的克隆和表达分析

LIM结构域蛋白是一个重要的发育调控因子,参与基因转录,细胞骨架建成和信号传导等许多发育调控过程,胞质骨架是形成和稳定细胞形态以及传递物质,能量和信息的重要成分。为研究棉花纤维细胞发育过程中胞质骨架的形成和作用机理,通过棉花纤维EST序列整合,从陆地棉徐州142胚珠（含纤维）中扩增并克隆出棉花LIM结构域基因的编码区段。该棉花LIM结构域基因（GhL1M1)长848bp,包含一个570bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列（189个氨基酸）与拟南芥,烟草和向日葵的LIM结构域蛋白有极高的同源性,而且两个LIM结构域完整,RT-PCR和Northerm杂交分析表明,该基因（GhL1M1）在陆地棉的根,茎尖,上胚轴,叶片,花蕾,花药,胚珠和不同发育时期的陆地棉纤维（4DPA、12DPA、18DPA）以及海岛棉纤维（18DPA）和中棉纤维（12DPA）中均有表达,但GhL1M1基因在茎尖,纤维和有纤维的胚珠中表达量更高,因此GhL1M1基因应与棉花纤维发育有密切关系。     

荔枝LcVSP1基因5′调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome Walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质Lc VSP1基因的5′调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,Lc VSP1基因的5′调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明Lc VSP1的5′调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.     

荔枝LcVSP1基因5''调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质LcVSP1基因的5'调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,LcVSP1基因的5'调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明LeVSP1的5'调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.     

桃PpMADS1基因启动子的克隆及功能分析

PpMADS1基因属于一类MADS box 基因,在植物的花发育调控中起着重要的作用。通过Genome Walking的方法从桃基因组中分离了长度为1 814bp的PpMADS1基因启动子片段,序列分析表明,在此启动子上不仅含有TATA box 和CAAT box基本元件,而且含有大量的与光调节有关的调控元件,如GT-1,Sp1和as-2-box,另外存在两个CArG-box元件、一个G-box元件和一个TGA-element,说明该启动子可能受光周期和激素的调控。将该启动子通过5′端缺失,分区段与GUS报告基因连接构建表达载体,并转化拟南芥。GUS组织化学染色分析结果表明,在-197到-454bp有促使GUS在花原基中表达的花原基特异性元件,在-454到-678bp之间存在促使GUS在萼片和花瓣表达的特异性元件,在-678到-978bp存在负调控作用元件,阻遏了GUS基因在花药中的表达。     

陆地棉‘徐州142’纤维不同发育时期蛋白质组比较分析

该研究以陆地棉‘徐州142’为材料,于开花后5、10、15、20、25、30d分别取样(棉铃)代表6个不同时期的棉纤维,利用双向电泳技术比较了棉纤维发育不同时期蛋白质组的变化,以明确不同发育阶段差异表达蛋白质及其功能与纤维发育之间的关系,为棉花产量和品质的改良提供理论依据。结果显示:(1)随着棉花的发育,棉纤维中的总蛋白含量逐渐降低,在开花后5d(5DPA)时棉花纤维中总蛋白的含量最高,达到11.7%,同时2-DE图谱中发现了15个明显的差异蛋白点;(2)运用MALDI-TOF-MS对差异蛋白质点鉴定结果发现,有5个明显的差异蛋白与棉花纤维发育相关,分别是GhSAM、GhPGK、GhCSD、GhFB和GhMDH蛋白;(3)开花后不同时期棉纤维蛋白质组的2-DE图谱表明,GhSAM、GhPGK1和GhMDH 3个蛋白在整个发育期都表达,但GhCSD从15DPA开始表达,GhFB从20DPA开始表达,而且GhSAM在15DPA时蛋白表达量最高,GhPGK1在10DPA时表达量最高,GhMDH、GhCSD和GhFB都是在30DPA时表达量最高。研究表明,棉纤维发育不同时期存在着差异蛋白,且在纤维发育不同时期蛋白的表达量也存在差异,同时这些差异蛋白参与能量代谢、碳代谢、细胞周期调控和发育等途径。     

水稻OsEBP-89基因的诱导表达

OsEBP-89基因是水稻中一个EREBP(ethyleneresponsive elements binding protein)类转录因子.Northern杂交检测出OsEBP-89基因的表达受激素及其类似物ACC、2,4-D、ABA、BR、JA、GA和6-BA的诱导,此外也受盐胁迫的诱导.通过序列比较在OsEBP-89基因启动子区找到一个类似乙烯应答元件(ethvlene responsive element,ERE),称为IVC box.实验表明IVC box能够和水稻未成熟胚乳核蛋白特异性结合;用IVC box和35S(-46)mini-promoter/GUS的融合结构转化水稻,在转基因水稻愈伤细胞中GUS基因的表达能被ACC诱导.然而,OsEBP-89基因5′调控区失去了IVC box及其上游序列后,受ACC诱导而表达的能力有所降低,但降低的幅度不大.推测OsEBP-89基因可能有不止一个受乙烯调控的位点.     

陆地棉徐-142种子无毛突变体的比较研究

应用陆地棉徐-142及其种子无短绒无长绒突变体(fl),对棉纤维的发育作了初步研究.扫描电子显微镜观察发现,fl突变体开花当天的胚珠基本没有突起,导致种子无毛.RT-PCR分析表明,在纤维起始期和延长期,野生型胚珠中E6和Expansin基因转录水平高,开花15d(DPA)前后达峰值,而在突变体胚珠中两个基因在整个发育期只有极低的表达.Cotmyb A是棉花Myb家族的一个成员,该基因在野生型胚珠发育过程中明显表达,但在fl胚珠中表达异常.在BT培养基中加入GA3,或IAA和GA3,可使离体fl胚珠部分地恢复纤维发生和生长的能力.此外,外源激素对培养的WT和fl胚珠中E6和Expansin基因表达的影响相似,而对Cotmyb A基因的转录几乎没有影响(这一点WT和fl胚珠也相似).结果提示,fl种子中E6,Expansin和CotmybA基因异常或极低水平的表达与种子无毛有关,产生这些异常的原因有待深入研究.     

一个棉花生殖器官优势表达基因的启动子功能分析

用棉花生殖器官优势表达启动子替代CaMV35S启动子是解决目前转基因抗虫棉存在“前期抗虫性强, 后期抗虫性弱”这一生产实践问题的关键. 运用反向PCR技术从陆地棉中分离到一个棉花生殖器官优势表达基因——腺苷酸核糖基化作用因子1 (Arf1)基因的启动子序列. 该启动子具有独特的结构特征, 不仅同时包含有转录起始子(initiator), TATA box, CAAT box和GC box这四种特异元件, 而且还包含有一个5′非翻译区的内含子. 通过构建四个启动子缺失突变体, 定向替换植物表达载体pBI121上的CaMV35S启动子, 并与GUS基因融合, 构建了4个植物表达载体. 用花粉管通道技术将它们导入到棉花中, 转基因棉花后代的GUS染色和荧光定量分析结果表明: Arf1启动子是一个典型的棉花生殖器官优势表达启动子, 它为棉花生殖器官性状的分子设计和抗虫棉的再创新提供了有用的工具.     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

陆地棉GhSDP1及其启动子的克隆与表达分析

三酰基甘油脂肪酶(SDP1)是催化三酰甘油降解的关键酶,在植物油脂代谢调控中起着重要作用.克隆棉花SDP1并研究其在3种胁迫下的表达分析,为解析棉花SDP1的生物学功能提供依据.以陆地棉品种冀丰1271为试材,克隆GhSDP1编码序列和上游启动子序列;利用PlantCARE分析GhSDP1启动子区顺式作用元件;qRT-...     

Spatiotemporal manipulation of auxin biosynthesis in cotton ovule epidermal cells enhances fiber yield and quality

The capacity of conventional breeding to simultaneously improve the yield and quality of cotton fiber is limited. The accumulation of the plant hormone indole-3-acetic acid (IAA) in cotton fiber initials prompted us to investigate the effects of genetically engineering increased IAA levels in the ovule epidermis. Targeted expression of the IAA biosynthetic gene iaaM, driven by the promoter of the petunia MADS box gene Floral Binding protein 7 (FBP7), increased IAA levels in the epidermis of cotton ovules at the fiber initiation stage. This substantially increased the number of lint fibers, an effect that was confirmed in a 4-year field trial. The lint percentage of the transgenic cotton, an important component of fiber yield, was consistently higher in our transgenic plants than in nontransgenic controls, resulting in a >15% increase in lint yield. Fiber fineness was also notably improved.