N端二硫键对11家族木聚糖酶热稳定性的影响

以来源于米曲霉Aspergillus oryzae的11家族常温木聚糖酶AoXyn11A为母本,将其N端替换成同一家族耐热木聚糖酶EvXyn11TS的对应片段,构建出耐热杂合木聚糖酶AEx11A。将AoXyn11A和AEx11A基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析比较温度对表达产物酶活性的影响。结果表明,AEx11A的最适温度Topt为75℃,在70℃的半衰期t1/270为197 min,较AoXyn11A(Topt=50℃,t1/270=1.0 min)显著提高。通过对AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对,发现在AEx11A的N端引入了一个二硫键(Cys5–Cys32)。利用定点突变法将其5位的半胱氨酸突变为苏氨酸(C5T),去除该二硫键,以探讨其对AEx11A热稳定性的影响。分析表明,突变酶(AEx11AC5T)的Topt由突变前的75℃降为60℃,其t1/270和t1/280也分别由197 min和25 min缩短为3.0 min和1.0 min。     

V1C、G116D、N171H定点突变对黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

[目的]探索V1C、G116D、N171H定点突变对木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性的作用。[方法]生物信息学方法确定木聚糖酶Xyn ZF-2可突变位点,引入Cys、Asp、His;定点突变V1C、G116D、N171H,PCR扩增突变基因xyn CDH,构建大肠杆菌表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白并测定酶活,分析酶学性质。[结果]突变酶Xyn CDH的最适温度由40℃上升到45℃。40℃条件下突变酶Xyn CDH半衰期t40℃1/2由55 min延长到60 min;在45℃条件下,突变酶Xyn CDH的半衰期t45℃1/2由7min提高到15 min。[结论]定点突变V1C、G116D、N171H能增强木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性,为加深木聚糖酶分子改造的研究提供参考。     

Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性

为改良米曲霉（Aspergillus oryzae）糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr¹³（Y13）置换为Phe（F）。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^Y13F;以重组质粒pPIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因（Aoxyn11A）中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因（Aoxyn11A^Y13F）;分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^Y13F在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^Y13F的耐热性进行了分析。结果表明：突变酶的最适温度T_opt由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^Y13F在50℃的半衰期t_1/2⁵⁰为95 min,较AoXyn11A（t_1/2⁵⁰=6 min）延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。     

定点突变提高里氏木霉木聚糖酶 (XYN II) 的稳定性

通过定点突变的方法,在来源于里氏木霉Trichderma reesei的木聚糖酶XYN II的N-末端两个β折叠片层间添加二硫键,以提高木聚糖酶的稳定性。原酶XYN-OU和突变酶XYN-HA12 (T2C、T28C和S156F) 分别在毕赤酵母中分泌表达,突变酶与原酶纯化后进行酶学性质比较。结果表明：突变酶最适反应温度由50℃提高到60℃;在70℃的半衰期由1 min提高到14 min;最适反应pH为5.0,与原酶保持一致,但是在50℃、30 min条件下的pH稳定范围由4.0~9.0扩展到3.0~10.0。对木聚糖酶分子改良的结果反映出在β片层间添加二硫键可以有效改善酶在较高温度下三维结构的刚性,提高热稳定性。     

常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌筛选 木聚糖酶高产菌株及其酶学性质研究

[目的]利用常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌,筛选耐热耐碱木聚糖酶高产菌株,并对其进行酶学性质分析,确保其适用于生物制浆漂白工艺.[方法]采用刚果红平板水解圈法结合摇瓶发酵胞外酶测定法进行菌株筛选,并通过DNS木聚糖酶活性测定等方法对来源于不同突变株的木聚糖酶进行酶学性质分析对比.[结果]筛选出遗传稳定性良好的两株木聚糖酶高产菌株AT24和AT22-2,以麦草浆为诱导底物的粗酶液中,突变株AT24及AT22-2所产的木聚糖酶活性分别为512.74、552.70U/mL,分别为原始菌株S.v的16和17倍的.来源于突变株AT22-2的木聚糖酶的最适反应pH为9.5,最适反应温度为90℃,在50℃-90℃温度范围内具有良好的热稳定性,在100℃条件下处理30 min剩余酶活仍为68％;突变株AT24所产木聚糖酶的最适反应温度为60℃,最适pH为10.0,在60℃-80℃的高温环境下,突变株AT24所产的木聚糖酶具有良好的热稳定性.[结论]突变株AT22-2所产具有耐碱耐高温性质的木聚糖酶,在应用领域尤其在纸浆造纸行业具有较大的潜在应用价值.     

C-端引入二硫键对黑曲霉木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

同源比对黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2氨基酸序列,模拟构建木聚糖酶三维结构,确定能够提高酶热稳定性的最佳突变位点。在C-端引入二硫键,突变xyn ZF-2 205位点的色氨酸和52位点的丙氨酸为半胱氨酸,获取突变基因T205C-A52C,表达于大肠杆菌BL21(DE3)。酶学性质比较发现,突变酶Xyn ZFT205C-A52C的最适温度为50℃,比原酶Xyn ZF-2提高了10℃;50℃保温5 min,突变酶相对酶活性为55.36%,原酶相对酶活性为32.62%;原酶与突变酶最适p H均为5.0,但相同p H下突变酶的相对酶活性较原酶高;突变酶的p H稳定区间由原酶的5.0~9.0扩大为3.0~9.0。因此,定点突变T205C和A52C在C-端引入二硫键能提高黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性及p H稳定性。     

通过N端引入芳香族氨基酸提高木聚糖酶的热稳定性

耐热的木聚糖酶具有用于造纸、麻类脱胶和饲料生产等工业领域的巨大潜力,为了提高11家族碱性木聚糖酶Xyn11A-LC的热稳定性,通过理性设计在N-末端引入了芳香族氨基酸(T9Y和D14F)。测定野生型和突变体的性质表明,突变体的最适反应温度和热稳定性均获得了提高。突变体的最适反应温度比野生型提高了5℃。野生型在65℃的Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中的半衰期为22 min,而突变体在此条件下的半衰期为106 min。圆二色光谱测定结果显示野生型和突变体的Tm分别为55.3℃和67.9℃。因此,通过在N-末端引入芳香族氨基酸可以提高11家族木聚糖酶的热稳定性和在高温下的活性。     

定点突变提高木聚糖酶Umxyn10A的热稳定性

木聚糖酶是微生物半纤维素降解体系中的一种关键酶,被广泛地应用在工业中的多个领域。本研究为了提高木聚糖酶Umxyn10A (ABL73-883.1)的热稳定性,将Umxyn10A与GH 10家族4种耐热木聚糖酶进行多序列同源比对以及三维结构的同源建模分析,选定了Umxyn10A第31位氨基酸位点进行定点突变,将氨基酸Ala (A)突变为Phe (F)。分别将Umxyn10A和Umxyn10AA31F在大肠杆菌中进行重组表达,分析2种重组酶的酶学特性,结果发现,Umxyn10AA31F的最适反应温度为85℃,较野生重组酶提高了5℃;在65℃下的半衰期为105 min,较野生重组酶(15 min)提高了6倍;在70℃下突变重组酶的半衰期为15 min,较野生重组酶(5 min)提高了2倍;与此同时突变重组酶的pH耐受区间较原酶也有一定的增大。结果表明,将第31位氨基酸位点Ala突变为Phe能够显著的提高Umxyn10A的热稳定性。     

人白细胞介素11的定点聚乙二醇修饰

利用人白细胞介素11（hIL-11）无半胱氨酸（Cys）残基这一特点,通过定点突变将一个Cys残基引入hIL-11的N末端。然后,利用与Cys 巯基特异性反应的mPEG-马来酰亚胺将mPEG偶联到预先选定的位点,经层析纯化得到hIL-11的定点PEG修饰物。利用依赖型细胞株7TD1测定其生物学活性,结果表明,其体外生物学活性保持原有hIL-11活性的30%左右。定点聚乙二醇修饰方法为定向改造hIL-11,提高其药效的应用研究打下基础。     

K178M、S170F、G180V突变对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

利用生物信息学分析黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2,选择α-螺旋178位点、170位点和180位点氨基酸进行定点突变(K178M,S170F,G180V)获得突变木聚糖酶基因xyn MFV,构建重组表达载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)诱导表达。酶学性质分析对比发现,突变酶最适温度(50℃)比原酶(40℃)提高了10℃;40℃条件下保温1 h突变酶Xyn MFV相对酶活力下降到热处理前的56.0%,原酶Xyn ZF-2下降到42.0%;45℃时突变酶Xyn MFV的半衰期t_(1/2)为21 min,与原酶Xyn ZF-2(t_(1/2)=7 min)相比较提高了14 min。结果表明,K178M、S170F、G180V突变木聚糖酶可以提高Xyn ZF-2最适温度和热稳定性。