水稻白叶枯病菌基因XOO2193的突变体构建及其毒力和胞外多糖分析

水稻白叶枯病菌是一种引起水稻白叶枯病的植物病原细菌,水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一.本研究采用携带同源序列的自杀质粒pK18MobGⅡ整合的办法构建了水稻白叶枯病菌中国菌株13751编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因XOO2193的非极性突变体GNM2193.对突变体的表型分析发现其毒力在杂交水稻品种特优63上显著减弱,突变体在非寄主植物蓖麻上不能引起过敏反应.此外,突变体胞外多糖的产量是野生型的43.4%.用一段含有XOO2193基因的DNA 片段对GNM2193进行功能互补,互补菌株在水稻上的毒力、引起过敏反应的能力和胞外多糖产量恢复到野生型水平.说明XOO2193基因与病菌的毒力和胞外多糖的产生有关.     

纤维素降解真菌A25-2的分离、鉴定及其产纤维素酶的酶学特性

本研究以Avicel-刚果红选择培养基为初筛培养基,从云南哀牢山国家级自然保护区和广西猫儿山国家级自然保护区的土壤样品中分离筛选得到4200株真菌,从中筛选出透明圈与菌落直径比较大、透明程度较为清晰的12个菌株。通过液体培养发酵,测定其上清液中的羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力和Avicel酶活力,最终筛选出一株产该三种酶且其活力均最高的真菌菌株A25-2。通过对菌株A25-2形态学观察和其内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列同源性比对分析,将菌株A25-2鉴定为哈茨木霉(Hypocrea lixii)。酶活测定结果表明菌株A25-2产纤维素酶的酶活力较高,在最适作用pH4.5和最适作用温度55℃下,其羧甲基纤维素酶活力为2.26IU/mL,滤纸酶活力为0.58IU/mL,Avicel酶活力为0.39IU/mL。薄层层析实验表明A25-2具有完整的纤维素酶系统。因此,真菌A25-2可作为饲料加工等生产和纤维素酶相关研究的备选菌株。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ用pET_(31)b载体的表达和纯化

化学全合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因在大肠杆菌中被表达 ,采用pET31b载体 ,表达产物N端为大肠杆菌酮基立体异构酶的融合蛋白 ,经亲和连续 6个组氨酸的亲和柱层析后 ,溴化氰切割融合蛋白 ,再经高效液相色谱反相柱纯化 ,得到了重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ .质谱分析及N端测序表明 ,rHWTX Ⅰ系正确表达产物 .还原复性的rHWTX Ⅰ表现出与天然HWTX Ⅰ一致的生物学活性     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属(Aspergillus sp.)的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/(min·mg),最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3+、Zn2+、Cu2+对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ用pMAL-p2X载体的表达和纯化

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ基因通过PCR扩增 ,插入pMAL p2X载体 ,基因 5′端插入凝血酶切割位点 .在大肠杆菌中经IPTG诱导高效分泌表达 .表达产物N端含麦芽糖结合蛋白 ,融合蛋白被分泌到大肠杆菌的胞间质 .经冷渗透休克后 ,透析脱盐 ,用凝血酶切割融合蛋白 ,再经SuperdexTM75分子筛柱层析、高效液相色谱反相C18柱纯化 ,得到重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ .质谱分析表明 ,rHWTX Ⅺ系正确表达产物 ,重组HWTX Ⅺ表现出与天然HWTX Ⅺ一致的生物学活性 .     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶玉基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉(Trichoderma harzianum) A25-2总RNA中利用RT-PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP-GH中,用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉(Trichoderma viride) HP35-3中,筛选得到12个转化子。以p-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv/CDHl-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35-3的3.8倍。SDS-PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25-2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

定点突变提高木聚糖酶Umxyn10A的热稳定性

木聚糖酶是微生物半纤维素降解体系中的一种关键酶,被广泛地应用在工业中的多个领域。本研究为了提高木聚糖酶Umxyn10A (ABL73-883.1)的热稳定性,将Umxyn10A与GH 10家族4种耐热木聚糖酶进行多序列同源比对以及三维结构的同源建模分析,选定了Umxyn10A第31位氨基酸位点进行定点突变,将氨基酸Ala (A)突变为Phe (F)。分别将Umxyn10A和Umxyn10AA31F在大肠杆菌中进行重组表达,分析2种重组酶的酶学特性,结果发现,Umxyn10AA31F的最适反应温度为85℃,较野生重组酶提高了5℃;在65℃下的半衰期为105 min,较野生重组酶(15 min)提高了6倍;在70℃下突变重组酶的半衰期为15 min,较野生重组酶(5 min)提高了2倍;与此同时突变重组酶的pH耐受区间较原酶也有一定的增大。结果表明,将第31位氨基酸位点Ala突变为Phe能够显著的提高Umxyn10A的热稳定性。