澜沧江-湄公河中上游淡水鱼类多样性

澜沧江-湄公河是东南亚最大的河流, 也是世界上淡水生物多样性最高的三大河流之一。由于特殊的地理位置和国际河流属性, 澜沧江-湄公河淡水鱼类的多样性现状仍缺乏系统的认识。本文在近20年调查的基础上, 系统整理了澜沧江-湄公河中上游32个支流或亚流域的淡水鱼类物种名录, 在此基础上对其种类组成和分布进行了分析, 并利用分类学多样性指数对澜沧江-湄公河中上游流域的物种多样性进行了评估。结果表明, 澜沧江-湄公河中上游共记录了淡水鱼类745种, 分属于2纲17目63科229属, 其中鲤形目鱼类451种, 占物种数的60.5%。分类学多样性指数显示, 从源头到中游, 淡水鱼类在分类阶元上的分布越来越均匀, 亲缘关系越来越远, 分类多样性越来越高。聚类分析(cluster analysis, CA)和多维尺度分析(multi-dimensional scaling, MDS)表明, 当Jaccard相似性系数为8.69时, 澜沧江-湄公河中上游32个亚流域可以分为源区、上游和中游3组; 相似性分析(ANOSIM)结果显示, 各组之间淡水鱼类组成差异显著(R = 0.877, P = 0.001)。相似性百分比分析(similarity percentage analysis, SIMPER)结果表明, 导致3组差异性的鱼类主要是鲤形目和鲇形目鱼类, 且随着地势阶梯的升高出现了科级、属级类群的替代。近几十年来, 随着流域各国人口的增长和经济的快速发展, 澜沧江-湄公河鱼类多样性和渔业资源面临严重威胁, 未来需加强流域内国家间合作, 在流域尺度上制定科学保护计划。     

Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性

为改良米曲霉（Aspergillus oryzae）糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr¹³（Y13）置换为Phe（F）。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^Y13F;以重组质粒pPIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因（Aoxyn11A）中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因（Aoxyn11A^Y13F）;分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^Y13F在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^Y13F的耐热性进行了分析。结果表明：突变酶的最适温度T_opt由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^Y13F在50℃的半衰期t_1/2⁵⁰为95 min,较AoXyn11A（t_1/2⁵⁰=6 min）延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。     

ccpA基因对蜡样芽胞杆菌氨肽酶生产的影响

【目的】构建蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ccp A缺失菌株,并初步探索ccp A基因对其碳代谢及氨肽酶生产的影响。【方法】利用温敏型质粒p KSV7构建蜡样芽胞杆菌CZ ccp A基因缺失突变株CZΔccp A,通过回补菌株对敲除株表型进行验证;不同碳源发酵对比菌株碳代谢的变化,进行氨肽酶发酵优化。【结果】成功构建ccp A缺失菌株CZΔccp A与回补菌株CZ1,三株菌在LB培养基中生长无差异;在柠檬酸钠以及甘露低聚糖为碳源时,菌株的代谢产生明显变化;以D-木糖为单一碳源时,氨肽酶的产量提高48.25%。【结论】CZ ccp A基因对柠檬酸钠、甘露低聚糖、D-木糖为单一碳源时的代谢可能具有调控作用,ccp A基因缺失可以提高蜡样芽胞杆菌CZ的氨肽酶产量。     

杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A~(loop)的H321对其酶学性质的影响

目的:将loop置换杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A~(loop)的H321突变回野生型酶AuMan5A对应的Gly,以分析杂合酶的酶学性质与H321的相关性。方法:采用大引物PCR技术将AuMan5A~(loop)基因(Auman5Aloop)编码H321的密码子CAC突变为Gly的GGT,构建突变酶基因Auman5A~(loop/H321G);借助表达质粒pPICZαA将该突变酶基因在Pichia pastoris GS115中实施表达,并分析重组表达产物AuMan5A~(loop) H321G的酶学性质。结果:AuMan5A~(loop/H321G)置换前后的最适温度T_(opt)均为75℃,高于AuMan5A的65℃;AuMan5A~(loop/H321G)在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)为300 min,介于AuMan5A(10 min)和AuMan5A~(loop)(480 min)之间;AuMan5A~(loop/H321G)比活性分别为AuMan5A和AuMan5A~(loop)的12.8和1.43倍;催化效率k_(cat)/K_m为后两者的14.1和1.12倍。结论:通过H321G置换及对3种酶的温度特性、比活性和催化效率的测定及比较,证实了H321对AuMan5A~(loop)的酶学性质有一定的影响。     

金沙江流域鱼类的系统保护规划研究北大核心CSCD

在全面整理和收集金沙江流域214种和亚种鱼类的分布及生物学特征的基础上,采用系统保护规划的方法,对流域内的鱼类保护进行了研究。首先,我们确定了物种分布的范围。对分布较广的种类,通过物种分布模型,结合气候、河流景观、土地利用、土壤等环境因子,预测物种在全流域内分布区;对其余鱼类则直接使用采样点作为分布区。其次,采用系统保护规划软件,规划了流域内保护区网络。在规划过程中,我们根据鱼类运动能力、分布广度和保护级别,设定了不同的保护目标,并对现有保护区的保护情况进行评估。结果表明,模型的最优解选择了486个单元共47950 km^2,占所有规划单元数量的7.7%。而被现有湿地相关保护区保护的规划单元仅包含了127种鱼类,占流域鱼类总数的59.3%,且其中109种仍需增加保护面积,说明现有保护区不足以保护流域内的鱼类;在现有基础上,保护区保护的规划单元面积至少需增加55.9%才能达成所设定的保护目标。     

定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化效率

【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低。为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDH~(Q88R),其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍。【目的】为进一步提高L-LcLDH~(Q88R)催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDH~(Q88R)底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile~(229)随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒p ET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDH~(Q88R)基因(LcldhQ88R)中编码Ile~(229)的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子。【结果】突变转化子(Escherichia coli/Lcldh~(Q88R/I229Q))表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile~(229)的双突变体L-LcLDH~(Q88R/I229Q)。重组表达产物L-LcLDH~(Q88R/I229Q)的酶学性质分析表明:L-LcLDH~(Q88R/I229Q)的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDH~(Q88R)的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍。L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大。根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDH~(Q88R/I229Q)在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶。