葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析

以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43 kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。     

茶树CsNCED2基因的克隆和表达分析

该研究以铁观音茶树品种叶片为材料,通过RT-PCR技术,克隆了茶树脱落酸(ABA)合成途径关键限速酶——9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因的全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 931bp,包含1 821bp完整开放阅读框,共编码606个氨基酸残基。NCBI同源分析结果表明,与葡萄VvNCED2相似性最高(78%),命名为CsNCED2(NCBI登录号:MF765770)。氨基酸序列分析显示,其具有NCED家族的FLNO2258保守结构域,以及MIAHPKxDP和HDFAITE保守结构域序列;在保守区存在4个Fe2+活性组氨酸结合位点,N-端含有叶绿体转运肽。实时荧光定量PCR分析表明,CsNCED2基因在铁观音叶、茎和花中表达量较高;白茶萎凋和乌龙茶做青均可以诱导CsNCED2基因显著上调表达;除干旱胁迫抑制CsNCED2表达外,ABA和低温胁迫均能够诱导CsNCED2基因显著上调表达。表明CsNCED2基因在茶树ABA合成代谢以及胁迫响应中发挥重要作用。     

木薯MeHB2转录因子的克隆与表达分析

该研究以木薯(Manihot esculenta Crantz)Ku50为实验材料,采用RT-PCR方法从叶片中克隆了1个HD-Zip基因MeHB2。MeHB2基因含有882bp的开放阅读框,编码293个氨基酸。蛋白质保守结构预测显示,MeHB2编码的蛋白含有Homeodomain、Leu zipper和HD-Zip_N等结构域,属于HD-Zip II成员。进化树分析表明,MeHB2与麻疯树、杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,低温胁迫、渗透胁迫、ABA和H2O2均可诱导MeHB2基因的表达,而盐胁迫抑制其表达。此外,MeHB2的表达量还受到遮荫胁迫的诱导。研究表明,MeHB2在木薯非生物逆境调控中扮演重要角色。     

葡萄Alfin like转录因子家族的鉴定和表达分析

Alfin like (AL) 转录因子家族对高盐、低温、干旱等非生物胁迫反应具有重要的调控作用。该研究采用同源比对的方法检索鉴定葡萄AL转录因子家族基因、分析其生物信息学特性,并采用qRT PCR方法分析非生物胁迫下AL基因的表达特征,以探究葡萄AL基因在非生物逆境胁迫中的功能。 结果表明：(1)在葡萄中共鉴定出6个AL基因家族成员,分别命名为VvAL1~VvAL6,且6个成员分别分布在6条染色体上。(2)葡萄中AL转录因子具有高度保守的DUF3594结构域和PHD结构域,各家族成员均含有5个外显子和4个内含子;上游启动子区域分析发现大量植物激素与非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。(3)基因芯片表达模式分析显示,盐、干旱、ABA胁迫以及低温(5 ℃)处理均显著影响葡萄AL家族基因(VvAL1~VvAL6)的表达。(4)qRT PCR检测显示,不同胁迫处理下AL基因在葡萄叶片中的表达水平不同;ABA处理下葡萄AL转录因子家族基因表达量较对照均显著下调,但在PEG处理下差异不显著;在盐胁迫处理下,VvAL2、VvAL4、VvAL5基因的表达量均显著上调,分别是对照的23倍、8.5倍和10.5倍,而VvAL1和VvAL6基因的表达量均显著下调,分别是对照的33倍和25倍。研究发现,葡萄AL转录因子家族与植物激素和非生物胁迫密切相关,尤其是该家族基因强烈响应高盐胁迫。     

番茄DEAD-box RNA解旋酶基因SlDEAH1的克隆及表达分析

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄(Solanum lycopersicum)AC++中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明:SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA3、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

木薯MePIL1基因克隆与表达分析

旨在克隆木薯Me PIL1基因,揭示其在木薯遮荫等非生物逆境胁迫中的作用。用RT-PCR的方法从木薯栽培种Ku50叶片中克隆Me PIL1基因,对其进行序列比对和系统进化树分析,研究其在木薯野生种和栽培种之间的结构变异,并应用荧光定量PCR技术分析其表达特性。结果显示,克隆获得木薯Me PIL1基因,该基因具有一个1 578 bp的开放阅读框,编码525个氨基酸,含有一个HLH保守结构域。系统进化树分析表明,Me PIL1与其在杨树和杞柳中的同源基因聚在一起,亲缘关系较近。基因结构变异分析显示,Me PIL1在HLH结构域非常保守,其结构变异主要来自于栽培种与野生种之间的差异,且整体上分布比较均匀。表达分析结果显示,Me PIL1在叶片中高表达,而且其表达量受到遮荫和渗透胁迫的诱导。结果表明,成功克隆了木薯Me PIL1基因,并且Me PIL1在转录水平参与木薯对遮荫和渗透胁迫的应答。     

小麦TaTrxh9基因的序列特征及其对渗透胁迫的响应

硫氧还蛋白是一类广泛存在于植物中的低分子量氧化还原蛋白,在植物生长发育调控和逆境响应过程中发挥重要的调控功能。以小麦(Triticum aestivum L.)品种‘中国春’和‘洛旱2号’为材料,采用RT-RCR方法克隆了小麦硫氧还蛋白基因TaTrxh9,通过生物信息学方法分析了其染色体定位及序列特征,并利用qRT-PCR技术分析了该基因对渗透胁迫的响应模式。结果显示:(1)成功克隆到小麦TaTrxh9基因,序列分析发现TaTrxh9基因位于第1染色体群的短臂上,并将其3个部分同源基因命名为TaTrxh9-1AS、TaTrxh9-1BS和TaTrxh9-1DS。(2)TaTrxh9基因包含4个内含子,且在内含子区域3个部分同源基因间序列差异较大;3个部分同源基因的编码区序列一致性在98%以上,均编码131个氨基酸,且蛋白序列完全相同;TaTrxh9蛋白包含1个Trx-family保守域和CXXC氧化还原活性位点,三维结构预测分析显示该蛋白可形成典型的硫氧还蛋白空间结构,包括由4个α螺旋组成的外围框架和由5个反向平行的β折叠组成的中心轴。(3)qRT-PCR分析显示,TaTrxh9基因受干旱胁迫诱导在叶片中下调表达,而在根系中呈先上调后下调的表达模式;盐胁迫过程中,TaTrxh9基因在叶片中无显著响应,在根系中也仅出现短暂的诱导表达现象;在ABA处理过程中,TaTrxh9基因表达模式与其对干旱胁迫的响应模式类似。研究推测,TaTrxh9基因对干旱胁迫的响应过程可能与ABA介导的基因表达调控有关。     

葡萄NIP基因家族的鉴定与表达分析

类根瘤菌26膜内在蛋白(nodulin 26 like intrinsic proteins,NIPs)是水通道蛋白的亚类,在植物营养获取和胁迫应答过程中发挥着重要作用。该研究利用多种生物信息学软件,对葡萄NIP家族基因进行分析,并采用RT PCR方法克隆得到4个NIP家族基因,利用qRT PCR方法分析非生物胁迫下NIP基因的表达特征。结果显示：(1)在葡萄基因组中,共鉴定到8个NIP基因,分布于葡萄4条染色体上,主要定位在质膜中;结构上含有6个跨膜结构域和两个典型的保守结构域NPA;氨基酸序列中存在很多个可能的磷酸化位点。(2)进化分析表明葡萄和拟南芥NIP基因具有较高的同源性,基因结构包含外显子数4~6个,保守基序种类和数量相似;基因启动子上游2 kb包含多种应答逆境和激素的顺式调控元件,其数量差异可能与基因本身功能相关。(3)NIP家族基因在不同组织中表达水平差异较大,多数成员在叶中表达水平较高,在茎中较低;成功克隆得到4个葡萄VvNIP基因,其长度分别为789 bp、606 bp、897 bp、789 bp,分别编码262、201、298、293个氨基酸。(4)qRT PCR结果显示,不同胁迫处理下NIP基因在葡萄叶片中的表达水平不同：低温处理下葡萄NIP基因大多呈显著下调表达;盐胁迫下,除VvNIP2 1、VvNIP4 2外其余家族基因均呈下调表达;干旱胁迫下VvNIP4 2显著上调。研究表明,VvNIP基因对多种胁迫均有响应,为葡萄逆境胁迫机制研究提供了参考。     

番茄 DEAD-box RNA 解旋酶基因 SlDEAH1 的克隆及表达分析简

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄（Solanum lycopersicum）AC⁺⁺中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明：SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA₃、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

葡萄蔗糖转化酶基因家族的生物信息学及响应逆境胁迫分析

蔗糖转化酶(invertase, INV)在植物生长发育和抵御胁迫中发挥着重要作用。研究从葡萄基因组数据库中鉴定出19个蔗糖转化酶基因,对基因结构和编码蛋白质的理化性质进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析基因在不同激素和非生物胁迫条件下的表达特征,为进一步探索葡萄INV基因家族参与葡萄逆境响应提供了一定的理论依据。结果表明,(1)该基因家族编码蛋白的氨基酸长度在150～766 aa之间,理论等电点介于4.43～9.1之间,亚细胞定位预测发现其主要在细胞质中表达,此外液泡和细胞壁也存在部分基因表达;(2)共线性结果显示VvCINV与其他5个物种复制频率较高;(3)保守基序分析表明VvCwINV包含了所有的保守基序,且Glyco＿32和Glyco＿hydro＿100是VvINV基因主要结构域;(4)组织特异性表达分析发现多数基因在葡萄生长发育进程中都有表达;(5)qRT-PCR分析结果显示,VvINV基因家族在叶片中对激素处理和非生物胁迫的响应出现上调,VvCINV1在50 mg/L GA₃和10%PEG处理后上调表达极显著,VvCINV4在盐胁迫、ABA...     

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白（pathogenesis related protein, PR） 10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃（Juglans sigillata）编码PR10的EST（expressed sequence tag）序列设计引物,利用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长cDNA序列,并命名为JsPR10-1。JsPR10-1全长cDNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5′-非编码区以及219 bp 3′-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。JsPR10-1编码的蛋白质与栎树（Quercus suber）、欧洲山毛榉（Fagus sylvatica）以及欧洲板栗（Castanea sativa）的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导JsPR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）后,JsPR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明JsPR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。     

藜钙依赖磷酸激酶基因CaCPK的克隆及胁迫表达

以耐盐植物藜(Chenopodium album)为材料,利用同源克隆技术获得了7个CDPK基因核心序列,并将其命名为CaCPK1–7。随后通过RACE技术成功获得CaCPK1–3的开放阅读框(ORF)序列,其ORF分别包含长度为1 632、1 704和1 590 bp的核苷酸序列。CaCPK1–3分别编码由543、567和529个氨基酸残基组成的钙依赖型蛋白激酶。定量PCR实验显示,CaCPK1–4受盐胁迫诱导明显上调表达,随胁迫时间增加不同基因呈现各异的表达规律。对CaCPK1–3在其它非生物胁迫下的表达分析显示,CaCPK1、CaCPK2和CaCPK3的表达均受外源ABA和H2O2的调控,H2O2合成抑制剂DPI和ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制300 mmol·L–1NaCl处理下CaCPK1、CaCPK2和CaCPK3的表达。研究结果为揭示藜在盐胁迫信号转导过程中CDPK基因家族的功能提供了理论依据。     

枣品种耐盐性与叶片生物膜结合态多胺水平和H~＋-ATP酶活性的关系

120mmol·L^-1NaCl胁迫30d,耐盐性强的‘金丝小枣’叶片细胞质膜、液泡膜共价结合态腐胺（Put）、亚精胺（Spd）、精胺（Spm）含量及多胺（PAs）总水平与对照无显著性差异,但耐盐性弱的‘冬枣’叶片质膜共价结合态Put、Spd、Spm含量和PAs总水平及液泡膜Spd含量均显著降低;‘金丝小枣’叶片类囊体膜共价结合态Put含量、PAs总水平较对照显著降低,‘冬枣’则是Put、Spd、Spm含量及PAs总水平均显著降低。盐胁迫下,‘金丝小枣’叶片细胞质膜、液泡膜、类囊体膜非共价结合态Put、Spd、Spm含量及PAs总水平下降,但其中仅类囊体膜Spd含量显著低于对照,而‘冬枣’的3种膜上非共价结合态的这些多胺及其总水平均显著低于对照。与对照相比,盐胁迫下耐盐性不同的2个枣品种,叶片细胞质膜、液泡膜和类囊体膜H＋-ATP酶活性均降低,但降低幅度因枣品种和生物膜种类不同而异,且H＋-ATP酶活性与相应膜结合态多胺水平存在极紧密的正相关关系。结果表明,膜结合态多胺参与枣品种耐盐性的表达,调节盐胁迫下枣叶细胞中溶质的跨膜运输。     

彩叶草中一个富亮氨酸重复相关蛋白基因SsLRP的克隆和分析

根据彩叶草叶片小型EST库中一条具有1个富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR）结构域的EST序列,采用RACE与文库结合的方法,克隆了1个具有5个LRR结构域的全长cDNA,SsLRP（LRR-Related Protein）（GenBank登录号FJ787729）。SsLRP cDNA全长1024bp,包含一个657bp的ORF框,编码218个氨基酸。其5’-UTR区含有2个终止子TAG,3’-UTR区具有推测的加尾信号AATAAA。SsLRP蛋白N端具有的信号肽和保守的亮氨酸拉链结构域,具有5个保守的LRR结构域,多个磷酸化位点和N-糖基化位点。多序列比对和系统进化分析表明,SsLRP与番茄SlLRP同源性最高。二级结构和三级结构预测表明,SsLRP的功能可能与保守的LRR结构域密切相关,推测该基因可能参与蛋白间的相互作用与信号识别。RT-PCR分析表明,SsLRP与番茄SlLRP具有相似的表达模式,在正常植株的根、茎、叶和花中都有表达,在受菌核病感染植株的茎和叶中表达上调。     

水稻病程相关PR1家族蛋白质在叶片生长及与白叶枯病菌互作反应中的表达

病程相关(PR)蛋白质经常被用作抗病反应的分子标记。利用免疫印迹(WB)技术检测了7个PR1家族蛋白质在水稻(Oryza sativa)叶片生长及与白叶枯病菌互作反应过程中的表达,发现6个PR1家族蛋白质在叶片生长中有表达。检测PR1蛋白质在Xa21介导的抗白叶枯病过程中的表达,结果显示PR1#052、PR1#072、PR1#073和PR1#121四个蛋白质在抗病反应后期呈上调或诱导表达,PR1#071则表达下调。进一步比较它们在抗病、感病和对照(Mock)反应中的表达丰度,发现在抗病和感病反应中的变化幅度均明显大于对照反应,推测这些PR蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用。另外,对PR1基因上游启动子区的cis元件进行了分析。该研究初步揭示了水稻PR1家族蛋白质的表达谱,为进一步了解PR1蛋白质的功能提供了线索。