构建溶瘤腺病毒的策略

溶瘤腺病毒是通过遗传工程改造的腺病毒,具有溶细胞复制周期的特性和特异靶向肿瘤细胞和裂解肿瘤细胞的功能。溶瘤腺病毒通过复制、释放子代病毒感染邻近肿瘤细胞。现在对腺病毒生活周期的认识水平,可以对其基因组进行改造从而使其特异性裂解肿瘤细胞而不杀伤正常细胞,并且构建了多种溶瘤腺病毒。本文主要概述了溶瘤腺病毒的三种构建策略:剔除腺病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中不需要的某些基因;利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因;对腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰,达到特异性结合肿瘤细胞的目的。     

构建一种受hTERT启动子和miR-145双调控的更为安全的新型溶瘤腺病毒

目的:构建一种受人端粒酶逆转录酶(h TERT)启动子和mi R-145双调控的更加安全的条件复制型腺病毒。方法:在已构建的h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的条件复制型腺病毒Adzq11基础上,再将四个拷贝的mi R-145的靶序列加入到E1A的3'非翻译区,构建新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T。应用Real-time PCR测定人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HLF中mi R-145的表达量;然后在这两株细胞中,分别转染Adzq11和Adzq11-145T对应的穿梭质粒及感染病毒本身,用Real-time PCR检测E1A表达量以测定调控效果;用病毒空斑单位法检测两种病毒的复制情况;用CCK8检测对A549和HLF细胞的杀伤作用。结果:构建的新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T在HLF中复制量明显低于Adzq11,其E1A m RNA水平和杀伤效应也显著降低。而在A549中,Adzq11-145T在E1A表达、病毒复制和溶瘤能力方面较Adzq11均无显著降低。结论:成功构建出一种新的受转录和转录后水平双重调控的条件复制型腺病毒Adzq11-145T,它比仅加入h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的腺病毒Adzq11更加安全。     

溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展

溶瘤腺病毒是一组通过基因工程构建的腺病毒、能够选择性在肿瘤细胞中完成感染-复制周期,从而特异性地杀伤、溶解肿瘤而不伤及其他正常细胞、组织,其作用机制包括：通过基因的缺失突变、插入特异性启动子、以及通过病毒结构蛋白的修饰等方面,实现肿瘤靶向治疗作用。本文就相关研究及进展进行综述。     

溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展

溶瘤腺病毒是一组通过基因工程构建的腺病毒、能够选择性在肿瘤细胞中完成感染-复制周期,从而特异性地杀伤、溶解肿瘤而不伤及其他正常细胞、组织,其作用机制包括:通过基因的缺失突变、插入特异性启动子、以及通过病毒结构蛋白的修饰等方面,实现肿瘤靶向治疗作用。本文就相关研究及进展进行综述。     

辅助病毒依赖型腺病毒载体研究进展

摘要：辅助病毒依赖型腺病毒载体（helper-dependent adenoviral vector,HDAd）缺乏所有腺病毒的编码序列,与非复制型的第一代腺病毒载体（first-generation adenovirus vector,FGAd）相比,具有载体免疫原性低、安全、转移容量大和持续表达等特点,现广泛用于遗传性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等的基因治疗和特异性靶向治疗研究。本文综述了HDAd构建和应用等方面的研究进展及未来的发展方向。     

人腺病毒感染动物模型的研究进展

人腺病毒感染常导致急性呼吸道疾病、结膜炎、肠胃炎甚至重症肺炎。目前,临床上尚无特效抗腺病毒药物。建立可支持腺病毒感染/致病的动物模型对于腺病毒致病机制研究及制定抗腺病毒策略至关重要。目前某些腺病毒的感染受体尚未阐明,以及临床上常见的B种腺病毒无法感染啮齿类动物,影响了对此类腺病毒感染的研究。此外,人腺病毒具有宿主范围的种属特异性,在感染的其它种属的动物细胞中由于宿主范围限制因子的存在,而不能有效复制、增殖,严重阻碍了对腺病毒体内致病机制的研究。本文综述了近年来人腺病毒感染受体、宿主范围限制因子以及感染模型等方面的进展,以期为新型腺病毒感染/致病动物模型的研究提供参考。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的:应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4(NSP4)的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法:构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果:获得了滴度为108.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1∶320和1∶1436.8;中和抗体效价1∶45.3和1∶71.8。结论:表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

目的：应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）的重组腺病毒,初步评价其免疫保护效果。方法：构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4,与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果：获得了滴度为10^8.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4,免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1：320 和1：1436.8;中和抗体效价1：45.3和1：71.8。结论：表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。     

杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析

本研究将在几乎所有肝癌细胞中均有高特异性的杂合启动子HREAF用于构建肝癌特异性溶瘤腺病毒。根据献报道的缺氧应答元件(HRE)和人甲胎蛋白(AFP)核心启动子(AF0.3)基因序列,设计并合成2对引物,采用PCR方法从肝癌细胞基因组DNA中扩增获得大小分别约为560bp的HRE DNA片段和310bp的AF0.3DNA片段,连接到pGEM—T Easy载体进行测序,证明获得了HRE和AF0.3的基因片段。将HRE和AF0．3的PCR产物分别进行PstI和SspI酶切并末端补平后直接连接,将此约700bp的连接产物克隆到pGEM—T Easy载体进行测序,证明杂合启动子HREAF构建成功。将HREAF亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle并在其后克隆入受其调控的腺病毒早期基因E1,构建成肝癌特异性溶瘤腺病毒穿梭载体pShuttle—HREAF—E1,经PCR及酶切鉴定。将pShuttle—HREAF—E1转染肺癌细胞株及AFP产量不等的不同人肝癌细胞株,经Ela的RT—PCR检测证实杂合启动子HREAF可调控目的基因在AFP产量不等的不同人肝癌细胞系中特异性高表达。杂合启动子HREAF及腺病毒穿梭载体pShuttle—HREAF—E1的构建为进一步研制肝癌特异性重组溶瘤腺病毒及其体内外肝癌特异杀伤作用的研究打下了基础。     

双靶向溶瘤腺病毒MD55对肿瘤细胞与正常细胞的杀伤作用比较

应用分子克隆和同源重组技术构建双靶向溶瘤腺病毒MD55.分析MD55病毒在细胞中的复制能力,并用MTT和结晶紫方法检测MD55对肿瘤细胞和正常细胞生长的影响,West-ern印迹检测病毒感染后细胞中E1A蛋白和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片断的表达.结果显示,MD55能在MN/CA9阳性的肿瘤细胞SW620和OSRC-2中特异性表达E1A蛋白.并且在这些细胞中的复制能力和对这些细胞的杀伤性与对照病毒ZD55基本相同,而其在正常细胞中的复制能力很弱,对正常细胞的伤害很小;同时MD55可诱导肿瘤细胞SW620和OSRC-2的凋亡,而对正常细胞的凋亡无影响.实验结果表明双靶向溶瘤腺病毒MD55靶向性和安全性比单靶向病毒ZD55更高,有望成为一种很好的肿瘤靶向基因一病毒治疗载体.