标化消减杂交:提高差异表达cDNA筛选效率的新策略

在回顾分析了消减杂交技术改进历程的基础上,我们提出了“标化消碱杂交策略”,此策略的核心是“用标化cDNA制备消碱杂交反应的单链驱动子和单链示踪子,分离回收消减杂交后的单链示踪子用于制备差异表达cDNA库,并从标化cDNA库制备探讨来对差异表达cDNA库进行检测”将主要用于筛选与细胞特殊表型密切相关的（或与不同发育阶段等密切相关的）呈“全或无”差异形式表达的低丰度全长cDNA。此策略有望能较以往的消减杂交策略在降低假阳性背景、提高低丰度差异表达cDNA获得率、得到较长甚至全长差异表达cDNA等方面有较好表现,但尚待检验。     

红火蚁与两种本地蚂蚁间的干扰竞争

为了探讨重大入侵生物红火蚁Solenopsis invicta Buren与本地蚂蚁的竞争机制以及红火蚁成功入侵的机理, 本研究以红火蚁和2种本地蚂蚁黑头酸臭蚁Tapinoma melanocephalum (Fabricius)及亮红大头蚁Pheidole fervida Smith为材料, 室内测定了红火蚁分别与黑头酸臭蚁、亮红大头蚁之间在个体水平和种群水平上的攻击性和攻击强度。一对一攻击试验结果表明：红火蚁和黑头酸臭蚁之间攻击级别多集中在Ⅲ级, 即竞争优势明显的红火蚁对黑头酸臭蚁缺乏激烈的攻击, 只是在相互攻击时多摆出威胁姿势; 红火蚁与亮红大头蚁之间攻击性较强, 尤其是红火蚁中型和小型工蚁与亮红大头蚁兵蚁之间的攻击性（3.35和3.30）显著强于红火蚁大型工蚁与亮红大头蚁兵蚁的攻击性（2.70）。群体攻击试验结果表明：与黑头酸臭蚁群体攻击的红火蚁各处理组合中, 无死亡红火蚁出现, 而黑头酸臭蚁死亡率为31.80%; 而与亮红大头蚁群体攻击中, 红火蚁死亡率为0.20%~12.00%, 而亮红大头蚁平均死亡率为49.91%。可见, 红火蚁的群体攻击能力强于黑头酸臭蚁和亮红大头蚁, 其中红火蚁与亮红大头蚁间的相互攻击程度激烈, 死亡率较高, 而与黑头酸臭蚁间的攻击程度较弱, 可能由于黑头酸臭蚁化学防御对本身起到一定的保护作用, 这为进一步加强红火蚁发生区本地蚂蚁优势种--黑头酸臭蚁的保护利用提供理论基础。     

杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析

本研究将在几乎所有肝癌细胞中均有高特异性的杂合启动子HREAF用于构建肝癌特异性溶瘤腺病毒。根据献报道的缺氧应答元件(HRE)和人甲胎蛋白(AFP)核心启动子(AF0.3)基因序列,设计并合成2对引物,采用PCR方法从肝癌细胞基因组DNA中扩增获得大小分别约为560bp的HRE DNA片段和310bp的AF0.3DNA片段,连接到pGEM—T Easy载体进行测序,证明获得了HRE和AF0.3的基因片段。将HRE和AF0．3的PCR产物分别进行PstI和SspI酶切并末端补平后直接连接,将此约700bp的连接产物克隆到pGEM—T Easy载体进行测序,证明杂合启动子HREAF构建成功。将HREAF亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle并在其后克隆入受其调控的腺病毒早期基因E1,构建成肝癌特异性溶瘤腺病毒穿梭载体pShuttle—HREAF—E1,经PCR及酶切鉴定。将pShuttle—HREAF—E1转染肺癌细胞株及AFP产量不等的不同人肝癌细胞株,经Ela的RT—PCR检测证实杂合启动子HREAF可调控目的基因在AFP产量不等的不同人肝癌细胞系中特异性高表达。杂合启动子HREAF及腺病毒穿梭载体pShuttle—HREAF—E1的构建为进一步研制肝癌特异性重组溶瘤腺病毒及其体内外肝癌特异杀伤作用的研究打下了基础。