核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展

核酸适配体是用配体指数富集系统进化技术(SELEX)在体外筛选得到的一小段寡核苷酸序列,能够选择性的与不同的靶标特异性的结合,包括蛋白质、小分子、有机物、金属离子、药物等,具有高亲和力和高特异性。这项技术的诸多优势,使其迅速得到重视,核酸适配体在生物传感器、基因芯片、新药开发、纳米技术等诸多方面应用广泛。但是传统的SELEX方法操作繁琐,筛选周期长,需要几个月的时间才能筛选出与靶标具有高特异性的核酸适配体。随着SELEX的快速发展,近年来出现了很多新型的筛选方法,这些新的方法大大提高了筛选周期,极大的提高了筛选效率,拓展了核酸适配体的应用。总结介绍了近三年来出现的几种新型的核酸适配体的筛选方法,包括氧化石墨烯SELEX(Multiple GO-SELEX)、单壁碳纳米管辅助细胞SELEX(SWCNTs-assisted cell-SELEX)、基于芯片的细胞SELEX(on-chip Cell-SELEX)、序列构造SELEX(Sequence-constructive SELEX)、高保真SELEX(High-Fidelity SELEX),有助于人们进一步了解、认识核酸适配体筛选技术的发展现状,更好促进核酸适体在各个领域中的应用前景。     

综述与专论: 核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战

核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子,通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点,在生物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础,然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性（抗核酸酶降解能力）的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向,几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近,高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术（捕获-SELEX,Capture-SELEX）和均相筛选技术（氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX）。基于靶标固定的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题,由于其操作的简单性,目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件（文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度）和所获得的适配体的亲和力（K_D,解离常数,dissociation constant）和特异性,对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明,降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力,但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段,但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大,而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题,急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的K_D和特异性。统计数据表明,GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少,两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展,讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。     

适配体传感器检测抗生素的研究进展

抗生素作为一种微生物的次级代谢产物,具有杀死或抑制微生物生长的作用。抗生素的滥用导致了它在食物中的残留量逐年增加。因此,需要建立一种快速灵敏检测方法用于食品中抗生素残留量的检测。核酸适配体传感器因其高选择性、高特异性和高灵敏性等优点而备受关注。同时,借助纳米材料独特的光、电特性,能够进一步提高适配体传感器的性能。本文综述了目前用于抗生素检测的核酸适配体传感器如荧光适配体传感器、比色适配体传感器和电化学适配体传感器等的研究进展。此外,还对该研究领域面临的挑战和未来前景进行了展望。     

基于表面等离子共振的适配体传感器应用研究进展

基于表面等离子共振的适配体传感器是利用适配体进行高特异性、高灵敏度、高通量检测的新型生物传感器。我们在简要阐述适配体的筛选方法、偶联技术及适配体传感器工作原理的基础上,结合最新的研究结果,对基于表面等离子共振的适配体传感器在生物活性小分子检测、传染病检测、肿瘤标志物检测、食品安全监测等方面的应用研究进展进行了综述。     

适配体结合蛋白质靶标的亲和力表征方法及其在疾病诊断中的应用

核酸适配体是通过体外指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选获得,并能够和蛋白质靶标高特异性、高亲和力结合的单链寡核苷酸。核酸适配体不但具有抗体的识别特性,而且具有自己独特的优良性能,目前已应用于分析检验、食品安全和生物医药等各个领域。蛋白质具有多种多样的生物功能以及临床诊断价值。因此,核酸适配体针对蛋白质靶标并在蛋白质相关的基础研究领域受到广泛的关注。核酸适配体应用性能的优劣取决于与其靶标蛋白质的亲和力与特异性。本文主要综述核酸适配体对蛋白质靶标的亲和力表征方法,以及在药物研发、肿瘤检测、生物成像以及生物传感器方面的应用。     

核酸适配体在肿瘤诊断和治疗中的应用研究

随着科学技术的飞速发展,适配体在各个领域的研究也备受关注,特别是在肿瘤治疗研究方面。核酸适配体是一类通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology,SELEX)获得的,具有独特三维构象的单链DNA或小分子RNA。核酸适配体能高亲和力和高特异性的与靶点结合,同时具有无免疫原性、相对分子质量小、靶标分子范围广、热学及化学稳定性高等特点。目前核酸适配体广泛应用于疾病的诊断、治疗、生物标志物筛选、生物传感器、新药研发等领域。现将核酸适配体的特点、筛选、及在肿瘤诊断和治疗中的研究作一综述。     

食源性致病细菌适配体生物传感器研究进展

食品安全是如今大众关注的焦点,而食源性致病细菌是导致食品安全问题事件频发的主要原因之一,因此需要开发一种快速灵敏便宜的检测方法,对食源性致病细菌进行监督检测。适配体是在体外基于SELEX技术,从单链寡核苷酸随机文库中筛选出的对靶标具有高亲和性、特异性的寡核苷酸(DNA或RNA)片段。由于食源性致病细菌的表面结构物质复杂,基于SELEX技术的适配体筛选方式被不断改良。本文介绍了几种SELEX改良技术,同时对适配体结合力的十种表征方法进行了比较,并对几种常见食源性致病细菌重要的(DNA、RNA、劈裂)适配体进行总结。由于适配体具有众多优于抗体的特性,用于食源性致病细菌检测的适配体生物传感器得到快速发展,其中电化学传感器及光学传感器应用最为广泛。对食源性致病细菌的光学适配体传感器与电化学适配体传感器的最新研究进展进行重点综述,并提出了未来适配体传感器的发展趋势,旨在为微生物检测技术开拓新领域,指引新方向。     

适配体传感器在微生物检测中的应用

适配体是一类特异的核酸序列,具有靶分子广、特异性强、稳定等优点.该类核酸分子在体外通过SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术(系统进化的指数富集技术)鉴定和筛选得到.相对于抗体,适配体为诊断和检测分析系统中的识别配基提供了另一个选择.适配体生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合,从而检测目标化合物的分析装置.适配体生物传感器在微生物检测方面具有分析速度快、灵敏度高、专一性强等特点,在微生物检测中显示出良好的应用前景.介绍了适配体、SELEX流程以及适配体传感器,综述了适配体传感器在微生物检测中的应用.     

综述与专论: 基于核酸适配体传感器的即时检测（POCT）技术

即时检测（point-of-care testing，POCT）是一种检测成本低、检测速度快、准确度高、能自我采样获得临床诊断结果的新型诊断技术。该技术在临床诊断、病情监控与疫情防控等领域发挥了重要作用。核酸适配体是一种能够特异性识别多种靶标的分子探针，具有易合成、批间差异小、易实现信号放大等突出优势，是生物医学传感器中重要的分子识别元件。本文概述了核酸适配体探针的现有筛选方法和进展，总结了核酸适配体POCT传感器信号放大策略，着重介绍了各类核酸适配体传感器在POCT领域的应用现状，并对核酸适配体POCT传感器的发展前景进行了展望。     

适配体在受体和分子传感器中的应用研究进展

适配体是从随机寡核苷酸文库中筛选得到的一类可以结合特异靶分子的寡核苷酸序列,在生物医学中具有极其诱人的应用前景.与传统抗体相比,由于具有制备简便、易于修饰、稳定性好,以及结合目标物范围广等特点,适配体已广泛应用于生物传感器的开发,一方面可以用作敏感元件,用于实现对靶分子的识别和检测;另一方面,可以作为敏感元件与传感器件耦合的桥梁,提高耦合的效率.此外,近年来在基于适配体的生物传感器中引入各种纳米材料例如金属纳米颗粒、碳材料和功能性纳米球等也促进了基于适配体的生物传感器在分析性能和商业应用等方面的提升和改进.本文首先简要介绍了基于SELEX技术筛选适配体的方法,总结了适配体的基本特性;其次,详细概括和总结了适配体生物传感器的基本原理及其分类;随后,结合近年来基于适配体的生物传感器领域的最新研究成果,重点介绍了适配体在生物传感器开发中的应用,主要包括在仿生嗅觉与味觉受体传感器方面的应用以及在检测小分子物质和蛋白质的应用;最后,对适配体在生物传感器中的应用面临的问题及其发展趋势进行了分析和展望.     

孔雀石绿适配体生物传感器的研究进展

荧光适配体作为一种无需标记的荧光探针,具有许多潜在的优势,并被应用于多种靶物质(如ATP、RNA)的检测,是目前适配体研究领域的热点。孔雀石绿适配体(malachite green aptamer,MGA)属于荧光适配体,其能通过配体诱导折叠形成结合口袋,进而促进孔雀石绿(malachite green,MG)的发光。目前,已经筛选得到的MGA的种类较少,主要介绍了已知的MG RNA适配体及其变构体和MG DNA适配体的特性,以及影响MG-MGA复合物荧光强度的因素。同时,还对主要的MG衍生物和共聚物进行了总结。最后,综述了MGA在生物传感、荧光成像等方面的应用,并对MGA的发展方向进行了展望,以期为MGA在生物检测、生物成像等方面的应用提供指导。     

基于核酸适配体的生物分析新方法研究进展

核酸适配体是从随机文库中采用SELEX技术筛选所得的单链短链寡核苷酸片段(通常为15-80个ss DNA或ss RNA)。其能够折叠形成独特稳定的三维结构,通过静电相互作用,氢键,范德华力,碱堆叠或多种作用力组合特异性地与多种靶标结合。适配体因具有构象变化能力而被用作生物分析中的理想识别配体。目前,基于适配体的生物分析新方法得到广泛研究,并用于蛋白多肽类药物分析、疾病标志物诊断、外泌体检测、循环肿瘤细胞检测和病毒检测等方面。本文综述了核酸适配体用于生物分析方法开发的最新进展,比较和讨论不同分析方法,并对基于适配体的生物分析新方法提出了设想和展望,为开发新的生物分析方法和检测技术提供了思路和借鉴。     

小分子靶标与其核酸适配体亲和力的表征方法

核酸适配体是指通过SELEX筛选得到的能与靶标高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA。目前国内外具有高亲和性和高特异性结合的小分子靶标的核酸适配体依然很少,究其原因,一方面是因为小分子靶标的适配体难以筛选,另一方面是小分子靶标与其候选适配体亲和力表征方法难以确定。亲和力表征是确定适配体筛选成功与否的关键步骤,就现有的小分子靶标与其相应适配体亲和力表征方法进行了总结,包括纳米金比色法、等温滴定量热法、表面等离子共振、圆二色谱法、石英晶体微天平法、微量热泳动法和SYBR Green I染料检测法等,并分析了这些方法的优缺点及改进建议,以期有助于提高适配体表征效率。     

适配体与病毒性感染诊断及治疗

适配体（Aptamers）是通过指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术,从随机核酸文库中筛选出来的单链寡核苷酸,已在临床医疗及其他领域得到日益广泛的应用.与抗体相比,适配体具有很多优点,如高亲和力、高特异性、分子量小、几乎无免疫排斥反应、结构稳定、易于合成等.可用于适配体筛选的靶标范围非常广,包括有机小分子、蛋白、完整细胞及病毒颗粒等.迅速可靠的病原检测对于病毒性传染病的成功预防和治疗具有重要意义.随着严格筛选和快速分离技术的进步,适配体在病毒感染的检测治疗中显示出巨大的潜力.本文概括介绍了适配体在病毒研究方面的最新应用进展及未来前景.     

以完整细胞为靶子的SELEX技术研究进展

指数富集的配体系统进化（SELEX）是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力、高特异性核酸配基——适配体的体外筛选技术。自1990年以来,SELEX技术得到了迅猛发展,筛选的靶分子已由最初的单一物质发展到完整的动物细胞、细菌病原体等复杂靶子。以完整细胞为靶子的SELEX技术有其独特的技术优势,可以在筛选细胞上特定靶分子未知的情况下进行筛选,为药物筛选、临床诊断、疾病治疗和基础医学研究等带来了新的思路和方法。随着对适配体研究的深入,尤其是纳米材料与其相结合应用,该技术将在肿瘤诊断治疗及微生物检测领域具有更为广泛的应用前景。     

核酸适配体筛选的改良与优化策略

核酸适配体以其类似抗体的功能及诸多优于抗体的特点引起人们的广泛关注,如何利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX技术)来高效地筛选核酸适配体是其应用的关键。结合近些年核酸适配体的研究进展,为提高筛选效率及核酸适配体性能,针对适配体筛选三大不同环节所做的尝试及改良进行相关的阐述,包括初始随机寡核苷酸文库的设计与修饰、筛选过程所用方法及次级文库的制备、筛选过程后(Post-SELEX)核酸适配体性能的优化等;特别比较了筛选方法包括毛细管电泳SELEX、细胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微阵列SELEX和高通量SELEX,以及次级文库的制备方法诸如不对称PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等长PCR法、综合性方法等;对核酸适配体发展面临的问题及发展前景进行探讨,以期为相关科研人员的研究提供参考。     

适配体在食源性致病菌检测中的应用进展

适配体建立在仿生学基础上,是在体外从单链核酸随机序列库中筛选出的对某种靶物质具有高亲和度的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。相较于食源性致病菌的常规检测手段,适配体具备特异性强、稳定性好及易于修饰等优点,因此在该领域得到了关注和应用。但前人对适配体与靶物质结合的原理认识尚不够深入,对食源性致病菌的适配体筛选及应用总结还存在许多不足。结合食源性致病菌的自身结构特点,介绍了该类物质的适配体筛选特点和检测领域中的最新研究进展,提出了目前存在的问题及发展趋势。     

基于HT-SELEX筛选的节球藻毒素-R适配体的鉴定

节球藻毒素-R（nodularin-R,NOD-R）是具有强烈肝毒性的蓝藻毒素。然而,现有的NOD-R检测技术均存在一定的局限性,亟待开发一种新的检测方法。本文利用指数富集的配基系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术结合高通量测序（HT-SELEX）,筛选出NOD-R特异的高亲和力适配体。生物膜干涉（biolayer interferometry,BLI）技术对适配体的鉴定结果表明,适配体H62与NOD-R之间的亲和力最高,达到了168 nM。而且,该适配体不与其他毒素结合,具有较高的特异性。以上结果表明,适配体H62有望作为NOD-R检测新方法——适配体生物传感器的分子识别元件。     

综述与专论: 甾体激素核酸适配体的筛选与应用

核酸适配体作为新型的识别分子，在分析检测领域有极大的潜力。甾体激素是一类以环戊烷多氢菲为母核的激素，包括性激素和皮质激素，在维持生命、调节生理状态等方面有着极其重要的医药价值。监测体内外的甾体激素含量对于疾病监测和环境保护有着重要的意义。甾体激素的适配体筛选是将适配体应用到甾体激素的分析和检测的前提。目前研究者已通过筛选获得了雌激素（如雌二醇（estradiol，E2）、雌酮（estrone，E1））、雄激素（如睾酮（testosterone，TES）、去甲睾酮）、孕激素（如孕酮（progesterone，P4）），以及皮质激素（如皮质醇（cortisol，COR））的核酸适配体。本文总结了上述已报道的甾体激素适配体的筛选原理及策略；对适配体序列、平衡解离常数（equilibrium dissociation constants，K_D）及测定方法等进行了简要归纳；介绍了计算机模拟技术在适配体筛选和优化方面的新思路；对目前开发的各类甾体激素适配体传感器进行简要介绍，以期为后续研究提供参考。     

核酸适配体在食品安全可视化检测中的应用研究进展

近年来,随着食品安全事件频发,研究者们愈加重视发展低成本、高灵敏、易操作的现场快速检测技术。核酸适配体因其高特异性、高亲和力、易于修饰和功能化等优点而被广泛地应用于生物医学和分析化学研究领域,特别是核酸适配体的可视化检测技术备受关注。基于核酸适配体的可视化检测方法具有选择性好、特异强、灵敏度高、无需大型贵重仪器等诸多优点,已成为一种极具应用潜力的检测方法。本手稿主要对核酸适配体技术以及核酸适配体在食源性致病菌、真菌毒素、农兽药残留、重金属等食品有害物质的可视化检测研究进展进行综述。