米曲霉（Aspergillus oryzae）果胶酸内切水解酶（PGA）在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉（Aspergillus oryzae）一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR 的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A, PGA) 的cDNA,PGA cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pga 质粒。pET-28a (+)-pga 转化Turner (DE3) placⅠ细胞,得到转化子pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220 r/min条件培养pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ细胞,OD₆₀₀至 0.8左右时,用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside (IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活     

米曲霉（Aspergillus oryzae）果胶酸内切水解酶（PGA）在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉（Aspergillus oryzae）一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR 的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonase A, PGA) 的cDNA,PGA cDNA 连入pET-28a (+)载体, 构建 pET-28a (+)-pga 质粒。pET-28a (+)-pga 转化Turner (DE3) placⅠ细胞,得到转化子pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220 r/min条件培养pET-28a (+)-pga-Turner (DE3) placⅠ细胞,OD₆₀₀至 0.8左右时,用500μmol/L isopropyl β-D-thiogalactogalactopyranoside (IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24 h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87.5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活     

米曲霉(Aspergillus oryzae)果胶酸内切水解酶(PGA)在原核系统中重组表达

果胶酶具有广阔的商业用途,在食品工业上主要用于果汁和酒类的澄清、提高植物油的提取率、提高水果的硬度和植物纤维脱胶。米曲霉(Aspergillusoryzae)一直用于传统发酵食品的生产,自然条件下其果胶酶的产量较低。文献报道的果胶酶的重组表达成功的例子较少,且活性较低。通过RT-PCR的方法,获得不含信号肽的果胶酸内切水解酶A(polygalacturonaseA,PGA)的cDNA,PGAcDNA连入pET-28a( )载体,构建pET-28a( )-pga质粒。pET-28a( )-pga转化Turner(DE3)placⅠ细胞,得到转化子pET-28a( )-pga-Turner(DE3)placⅠ,首次实现了米曲霉PGA在大肠杆菌系统中过表达,进一步对PGA在大肠杆菌系统中表达的条件进行了研究。在37℃、220r/min条件培养pET-28a( )-pga-Turner(DE3)placⅠ细胞,OD600至0·8左右时,用500μmol/Lisopropylβ-D-thiogalactogalactopyranoside(IPTG)进行诱导表达,在15℃和170r/min条件下继续培养24h,表达效果最好,相对于每毫升培养基而言,产酶可达到70u/mL,是米曲霉自然条件产酶量的87·5倍,远优于文献报道的重组表达的PGA酶活。     

番茄P56和部分来源多糖裂解酶家族Ⅰ的其它蛋白的系统演化分析

果胶裂解酶包含果胶酸裂解酶(pectate lyase)和果胶酸酯裂解酶(pectin lyase)二种形式,是一类多糖裂解酶,由细菌、真菌、植物和线虫等生物产生,分布在5个多糖裂解酶家族,果胶酶在食品与饮料、纺织与洗涤、制药等工业中有广泛的应用。利用NCBI BLASTX服务器,搜索与番茄P56蛋白氨基酸序列相似且都属于多糖裂解酶家族Ⅰ的果胶裂解酶蛋白序列共28条,用DNAMAN软件分析其保守区,用CLUSTALX8.0软件进行序列比对和Bi-oEdit软件进行文件转换,进一步用PUAP4.0软件构建系统进化树。构建的MP树(phylogenetic trees)和NJ树(neighbor-joining)显示:来自植物的果胶酸裂解酶、真菌的果胶酸酯裂解酶、细菌的果胶酸裂解酶分别可聚为一个独立的类群;相对于细菌果胶酸裂解酶和真菌果胶酸酯裂解酶而言,构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的果胶酸裂解酶A和植物的果胶酸裂解酶之间有较近的亲缘关系;细菌Pseudomonas syringae的果胶酸酯裂解酶和真菌的果胶酸酯裂解酶之间的亲缘关系较近。     

番茄(Solanum lycopersicum)果胶酸裂解酶P56在大肠杆菌中的重组表达

果胶酸裂解酶P56在番茄花粉管伸长过程中起着重要的作用,为了制备番茄P56蛋白的抗体,进行番茄花粉管萌发过程中P56蛋白的免疫组织化学研究,对P56基因在大肠杆菌系统的重组表达进行了研究。先采用Overlap-PCR的方法,从番茄基因组DNA中克隆了成熟P56蛋白的cDNA序列(LAT56),再构建重组表达质粒pET28a( )-LAT56,转化大肠杆菌BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,得到了重组表达工程菌pET-28a( )-LAT56-BL21-Co-denPlus(DE3)-RIL。在0.5 mmol/L IPTG、15℃和180 r/min条件下,经过60 h的诱导培养,重组蛋白表达量为细胞总蛋白的30%左右,主要以包涵体形式存在,重组蛋白经Ni2 -nitrilotriacetate-agrose亲和柱层析,得到了SDS-PAGE显示为单一蛋白带的纯化蛋白。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

番茄(Solanum lycopersicum)果胶酸裂解酶P56在大肠杆菌中的重组表达

果胶酸裂解酶P56在番茄花粉管伸长过程中起着重要的作用,为了制备番茄P56蛋白的抗体,进行番茄花粉管萌发过程中P56蛋白的免疫组织化学研究,对P56基因在大肠杆菌系统的重组表达进行了研究。先采用Overlap-PCR的方法,从番茄基因组DNA中克隆了成熟P56蛋白的cDNA序列(LAT56),再构建重组表达质粒pET28a(+)-LAT56,转化大肠杆菌BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,得到了重组表达工程菌pET-28a(+)-LAT56-BL21-Co-denPlus(DE3)-RIL。在0.5 mmol/L IPTG、15℃和180 r/min条件下,经过60 h的诱导培养,重组蛋白表达量为细胞总蛋白的30%左右,主要以包涵体形式存在,重组蛋白经Ni²⁺-nitrilotriacetate-agrose亲和柱层析,得到了SDS-PAGE显示为单一蛋白带的纯化蛋白。     

禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析

果胶裂解酶是果胶酶的重要成员之一,能够通过B-消除作用,催化降解（1—4）-α-D-聚半乳糖醛酸。本研究首次鉴定出禾谷镰孢茵中的一个果胶裂解酶PelA,并在体外检测了其生化特性。PelA基因（FGSG_02386）的cDNA被克隆并进行了原核表达,同时构建了单基因敲除突变体。将重组质粒pET-28a（＋）-PelA转化蛋白表达菌株大肠杆菌BL21表达目的蛋白,纯化后的蛋白具有果胶裂解酶活性。酶活性测定结果显示,该酶的活性受到外界环境因素如温度、钙离子浓度和pH条件的影响,其最适反应条件为50℃,CaCl：浓度0-5mmol·L^-1,pH8-5。在侵染小麦胚芽鞘时PelA单基因突变体的毒力较野生型菌株并没有出现明显变化。     

裂殖壶菌酰基载体蛋白(ACP)基因的克隆与表达

ACP(Acyl carrier protein,酰基载体蛋白)参与高度不饱和脂肪酸的PKS(Polyketide synthase)生物合成途径.从Schizochytrium sp.FJU-512 cDNA文库中获得了ACP基因的cDNA克隆.该序列开放读码框全长429 bp,编码142个氨基酸,等电点为5.04,具有4'-磷酸泛酰巯基乙胺(4'-PP)的结合位点.利用BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切,并连接到原核表达载体pET-30a,构建了pET-30a/acp表达载体,转化宿主菌E.coll BL21(DE3),IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析表明该蛋白得到高效表达.     

果胶裂解酶产生真菌的选育及酶学性质研究

果胶裂解酶(pectin lyase)具有降解果胶物质的能力,在工业、医药等领域有着重要作用,目前主要由果胶裂解酶功能菌株进行工业发酵生产,但现已开发的能用于工业生产的菌株资源十分有限。本实验采用刚果红染色法从雅安果园富含果胶土壤中筛选果胶裂解酶产生菌株,旨在为果胶裂解酶工业生产开发新的菌株资源。实验最终筛选出一株果胶裂解酶产生真菌菌株,经形态学和分子生物学鉴定为丛梗孢目曲霉属(Aspergillus monilia)的黄曲霉(Aspergillus flavus)。发酵条件研究表明,其最佳培养基的组成为(g/L):桔皮粉3,麸皮5,K_2HPO_4 0.05,Mg SO40.05,在此组合下酶活可达1.48 U/m L;最适培养条件为:初始p H 8.0,接种量8%,温度30℃,摇床转速200 r/min,培养时间48 h。酶学性质研究表明:该酶的最适p H为8.0,在p H 7.0~9.0范围内稳定性良好;最适温度为50℃,在40~50℃范围内稳定性较好;Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有较明显的激活作用,Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)等对酶有不同程度的抑制作用。本研究成功对筛选菌株进行了发酵条件优化、酶学性质的研究,为果胶裂解酶工业生产菌株的选育以及实际应用提供实验依据。     

人PSF蛋白的原核表达及分析鉴定

PSF(polypyrimidine tract binding protein-associated splicing factor)蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白,能够抑制原癌基因的表达,在人和小鼠中具有肿瘤抑制的作用.以人成纤维细胞总RNA为材料,利用PSF特异性引物通过RT-PCR的方法扩增得到PSF...     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli

The complete gene xyn// that encodes endo-1,4-beta-xylanase secreted by Aspergillus usamii E001 was cloned and sequenced. The coding region of the gene is separated by only one intron. It encodes 184 amino acid residues of a protein with a calculated molecular weight of 19.8kDa plus a signal peptide of 27 amino acids. The amino acid sequence of the xyn// gene has higher similarity with those of family 11 of glycosyl hydrolases reported from other microorganisms. The mature peptide encoding cDNA was subcloned into pET-28a(+) expression vector. The recombinant plasmid was expressed in Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL, and xylanase activity was measured. The expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and a new specific band with molecular weight of about 20kDa was found when induced by IPTG. Enzyme activity assay verified the recombinant protein as a xylanase. A maximum activity of 49.6Umg(-1) was obtained from cellular extract of E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL harboring pET-28a-xyn//. The xylanase had optimal activity at pH 4.6 and 50 degrees C. This is the first report on the cloning of a xylanase gene from A. usamii.     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化

【背景】血红素加氧酶-1 (HO-1)具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化等多种生理效应,有望成为一种新型药物应用于临床疾病的治疗。【目的】构建表达HO-1的基因重组大肠杆菌(Escherichiacoli),并优化其表达培养条件,实现HO-1高产率的表达。【方法】PCR法克隆集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的HO-1基因(ho1),构建重组质粒pET-28a-ho1,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,单因素实验优化表达培养基的种类、诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度。【结果】构建了表达HO-1的基因重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,用甘油(GY)培养基培养至菌体浓度OD_(600)约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,30°C诱导培养6 h,HO-1的表达量最高,Ni-NTA柱分离纯化得到的HO-1收率占细胞总蛋白的10.9%。【结论】获得了可溶性表达HO-1的基因重组大肠杆菌及其较佳的培养条件,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌毒力因子Z1444的原核表达及其丝/苏氨酸激酶活性验证

目的:在大肠杆菌中表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)毒力岛上的毒力因子Z1444并纯化,对其丝/苏氨酸激酶活性进行初步检测。方法:根据GenBank中Z1444基因序列及pET-28a(+)载体的多克隆位点设计引物,以EHECO157∶H7全菌裂解液为模板,经PCR钓取1047 bp的目的片段,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-Z1444,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导蛋白表达并经SDS-PAGE鉴定,利用体外反应体系鉴定重组蛋白的丝/苏氨酸激酶活性。结果:双酶切和测序鉴定表明,pET-28a(+)-Z1444原核表达质粒构建正确;诱导表达后经纯化,获得纯度在90%以上的可溶性重组Z1444,相对分子量约为38×103;体外酶活实验验证了Z1444的丝/苏氨酸激酶活性。结论:Z1444在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,为后续功能验证奠定了基础。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。