柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母表达及其生物活性分析

将人可溶性晚期糖基化终产物受体(human soluble Receptor for advanced glycation end product,hsRAGE)cDNA插入巴斯德毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA,构建重组表达载体pGAPZαA-hsRAGE,并转化到毕赤酵母X-33中,利用含抗生素Zeocin的YPD平板筛选重组子。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型分泌表达,在发酵液中获得了相对分子质量约45 kD的重组蛋白。摇瓶发酵结果表明,在发酵温度30℃、pH6.0、发酵时间72 h时重组蛋白表达占发酵上清液总蛋白68.4%。Western blotting显示,重组蛋白能够被相应抗体所识别。纯化后的重组hsRAGE具有与AGEs相互结合的活性,并能够显著地抑制AGEs诱导的人血管内皮细胞系ECV-304细胞NF-κB信号通路中NF-κB/p65基因的表达。     

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675 bp地鳖虫纤溶活性蛋白 (fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列.将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2 kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符.重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性.     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp),根据 其基因序列,设计引物从pPIC9K2rHCMVp 上扩增得到目的基因片段,并导入毕赤酵母诱导型表达 载体pPICZαA 中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33 细胞中,筛选获得表达量 较高的重组菌株,研究了该菌株生长的培养条件,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH 值对人巨细 胞病毒嵌合肽表达的影响。2L 发酵罐进行了高密度发酵,经1 %的甲醇、pH610 的条件下诱导 48h,最终菌体密度OD600达到180,每升发酵液中含目的蛋白7817mg,产量比摇瓶提高了418 倍。 rHCMVp 可通过高密度发酵大量获得。     

嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶Ⅰ在毕赤酵母中的高效表达

嗜热毛壳菌ChaetomiumthermophilumCT2可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RT-PCR扩增cbh1成熟蛋白的编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.42mg/mL。表达蛋白分泌到培养基中,分子量约80kD;以脱脂棉为底物测得酶活为21U/mL。表达蛋白在60℃稳定,70℃保温60分钟仍保持90%的酶活力,具有较高的热稳定性。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中表达及活性研究

目的:在毕赤酵母中表达新疆家蚕抗菌肽基因(Cecropin-XJ)并检测其活性.方法:根据作者实验室已克隆获得的新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)基因设计引物,通过PCR方法扩增Cecropin-XJ,将PCR产物和表达载体pPIC9K用EcoR Ⅰ及Not Ⅰ双酶切,构建重组表达质粒pPIC9K-(Cecropin-XJ),酶切及测序正确后,电转化到毕赤酵母GS115,对分泌表达的重组蛋白进行活性检测.结果:PCR扩增获得192 bp Cecropin-XJ,成功构建pPIC9K-Cecropin-XJ,优化诱导条件证明在pH 6的BMMY培养液中,0.5%甲醇诱导约48h后,获得的表达产物活性较强,对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性,在100℃条件下,其活性可维持100min以上.结论:新疆家蚕抗菌肽在毕赤酵母中分泌表达,为大规模发酵生产奠定了基础.     

商陆抗病毒蛋白重组子筛选及发酵条件初探

目的：筛选体外高表达商陆抗病毒蛋白的毕赤酵母重组菌株,并摸索其适合的发酵条件。方法：通过电击转化将含有商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP）基因的分泌型表达载体PIC9K-P导入到毕赤酵母（Pachia pastoris）GS115菌株中。利用免疫印迹法筛选表达量较高的转化子。在摇瓶发酵水平对重组菌株产PAP条件进行初步研究。结果：高表达PAP的重组菌株在发酵时间为96h,10g/L的甲醇浓度,培养基pH值为6.0～6.4时PAP的表达量较高。结论：免疫印迹法适合用于毕赤酵母高表达重组菌株的筛选,重组毕赤酵母的PAP表达量可高达30mg/L。     

rSalmosin-Mel融合蛋白在毕赤酵母中表达及活性研究

[目的]构建rSalmosin-Mel融合蛋白毕赤酵母真核表达载体,建立表达纯化工艺并初步评价其抗肿瘤活性。[方法]rSalmosin-Mel基因同pPIC9K相连,构建pPIC9K/rD-M真核表达载体,电转化至毕赤酵母菌GS115中。对重组菌的发酵时间、甲醇浓度及培养基pH进行优化。采用QSepharose HP和Sephadex G-75层析技术纯化重组蛋白rD-M。通过MTT比色法检测rD-M对MCF-7细胞增殖的抑制作用。[结果]获得了高效分泌表达rD-M融合蛋白的酵母工程菌株,确定了在28℃、pH 6.0、浓度为1.5%甲醇诱导96 h发酵条件。通过层析纯化出纯度大于95%的重组蛋白。MTT实验结果表明,0.25、0.5、1、2和4 nmol/L的rD-M对MCF-7细胞增殖具有明显的抑制作用。[结论]实现了rSalmosin-Mel融合蛋白在毕赤酵母中最优条件下的分泌型表达,为其作为基因工程抗肿瘤药物奠定基础。