利用细胞质导入法选育嗜杀啤酒酵母

利用细胞质导入(Cytoduction)法中的核融合缺陷细胞融合技术,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D518菌株不做任何遗传标记,将嗜杀酵母5045菌株的嗜杀质粒转移到受体菌D518中,获得了具有两亲株优良性状的融合子KD102菌株。对融合子分析表明:融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5045的嗜杀质粒,而且受体菌D518的核基因被原封不动地保留下来,为异质体细胞(Heteroplasmon)。将融合子KD102菌株用于小型、中型及生产性酿酒试验,结果表明,具有与亲株D518同样的酿造特性。在发酵过程中,能抑制野生酵母污染,净化发酵体系。对于保证啤酒纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。     

酿酒酵母两种不同嗜杀菌的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株ＳＫ４（Ｋ１型）和ＥＲＲ１（Ｋ２型）为材料,分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性,两株嗜杀酵母具有相互杀死作用,其嗜杀活性与菌体生长有关。ＳＫ４和ＥＲＲ１的嗜杀质粒的比较表明：Ｍ１－ｄｓＲＮＡ质粒和Ｍ２－ｄｓＲＮＡ质粒分子量分别为１．７ｋｂ和１．５ｋｂ,两株菌的Ｌ－ｄｓＲＮＡ质粒均为４．０ｋｂ。用高温和紫外线处理嗜杀酵母,嗜杀活性随之消失,消除菌中的Ｍ－ｄｓＲＮＡ质粒也相应     

酿酒酵母两种不同嗜杀菌株的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株SK4（K1型）和ERRI（K2型）为材料,分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性,两株嗜杀酵母具有相互杀死作用,其嗜杀活性与菌体生长有关。SK4和ERRI的嗜杀质粒的比较表明：M1－dsRNA质粒和M2-dsRNA质粒分子量分别为1．7kb和1．5kb,两株菌的L－dsRNA质粒均为4．0kb。用高温和紫外线处理嗜杀酵母,嗜杀活性随之消失,消除菌中的M－dsRNA质粒也相应消失,嗜杀活性的消除率随菌株和消除剂的不同而变化。实验证明两株菌产生的毒素蛋白的最适嗜杀作用条件不同,最适pH和温度分别为4．8、16℃和4．0、22℃,但两种毒素蛋白均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著。     

电融合构建嗜杀啤酒酵母及其发酵性能的研究

以ＭＫ２－３：Ｋ＾＋Ｒ＾＋ｌｅｕ＾－ｐ＾＋（ｎ）为供体菌,ＡＳ２４２０－１;Ｋ＾－Ｐ＾－ｌｅｕ＾＋ｐ＾０（２ｎ）为受体菌,通过电融合技术构建一批嗜杀啤酒酵母。其中４株融合子具有较高的嗜杀活性,对这４株融合子的遗传性状、ＤＮＡ含主细胞大小、形态、嗜杀质粒ｄｓ－ＲＮＡ提取及电泳等研究表明,这４株菌具有双亲的互补性。对其中ＭＡＲ１的进一步实验表明,ＭＡＲ１的某些发酵性能接近甚至优于亲株ＡＳ２４２０－１,     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。     

嗜杀酵母的生物学功能及其应用

嗜杀酵母能够分泌毒素蛋白,杀死敏感酵母。嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力。嗜杀酵母的嗜杀特性与两种双链线状RNA(dsRNA)有关,即编码产生毒素蛋白的M-dsRNA和编码自身和M-dsRNA外壳蛋白的L-dsRNA。嗜杀毒素破坏细胞跨膜化学质子梯度,造成ATP和钾离子泄漏,导致细胞死亡。应用嗜杀酵母可避免野生型酵母污染,净化发酵体系,改善发酵产物品质;嗜杀毒素也可作为抵制病原酵母和类酵母微生物的抗真菌剂。     

一种检测酵母嗜杀活性的简便方法及其应用

本文以嗜杀酵母ＥＲＲＩ为材料建立了一种双层平板单菌落嗜杀活性检测法。此法与常规营养缺陷型筛选方法相结合,可直接筛选出具有嗜杀活性的酵母营养缺陷型菌株ＭＫ２—３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－,并成功地用于检测理化因子对嗜杀质粒的消除作用。进一步采用此法在直接混合培养中做出了嗜杀酵母对敏感酵母作用的动力学曲线。结果表明,敏感酵母活菌数在混合培养的对数生长后期开始急剧下降。     

啤酒酿造用凝集性酵母融合育种的研究

用红霉素抗性突变和小菌落呼吸缺陷突变,标记一株非凝集性啤酒酿造用酵母Saccha-romyces carlsbergensis B8然后与凝集性酵母 Saccharomyces carlsbergensis A43进行电诱导融合,获得五株稳定的凝集性酵母融合株。其中,F6、F7具有与亲株A43同等强的凝集特性,同时还保留了另一亲株B8的发酵力强,酿造风味好等生产性状。经测定细胞的DNA含量,五株融合株分别属于二、三、四倍体。用Octyl-sepharose CL-4B疏水柱层析法测定细晶表面的疏水性表明,A43和全部融合株的细胞表面疏水性能都比非凝集性亲株B8强,并与细胞的凝集性能呈正相关。     

啤酒酵母和产朊假丝酵母属间原生质体融合子的筛选

利用不可逆生化抑制剂碘乙酸抑制一亲株细胞的生理活性和利用两亲株细胞间生理性状的差异性,进行啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)原生质体融合子的筛选,属间原生质体融合率为3.47×10~(-6)。经菌落形态比较,碳化合物的同化和发酵,DNA含量测定,酯酶型分析,细胞核染色,产孢试验和自然的核分离实验证明,融合子分三种类型:87.21%产朊假丝醇母型;9.02%啤酒酵母型;3.77%真正核融合子型。     

原生质体融合技术选育耐热性β-淀粉酶产生菌

从土壤中分离到两株产β-淀粉酶芽孢杆菌菌株,经紫外线、丫-射线,氯化锂、亚硝基胍等诱变和筛选,得到β-淀粉酶高产菌和耐热性β-淀粉酶产生菌各一株。将两菌进行原生质体融合,获得兼有两亲株遗传特性的融合子wg6。从菌落形态和产酶特性等证实此融合子系两亲株融台所得的杂交子代。W96菌株产酶能力介于两亲株之间,酶的热稳定性较高,60℃处理15min,酶活力仍达93．2％。此菌株还可产生少量茁霉多糖酶(一种支链淀粉酶)．与所产生的β-淀粉酶协同作用,使淀粉水解率达到80．6％,因而有较高的应用价值。     

有淀粉糖化酶活性的耐高温酿酒酵母的构建研究

通过诱导Hu—TY一1(耐高温酿酒酵母)产孢及单孢分离得到的单倍体株Hu—TY—l—A(Sa-ccharamyces cerevisiae)与具有STAl、STA2、STA3(淀粉糖化酶)遗传因子的酵母(S．Dias-taticus)单倍体和纯合二倍体进行相同交配型的种间原生质体融合,融合率为3．3×1O^-6-8．7×1O^-6。融合子的细胞形态、大小、DNA含量、生长和发酵特性等方面均不同于亲株。融合株BA-2、BA-3、CA-18、DA-2、CCA-30、其细胞体积与DNA含量为亲株之和,30℃生长速率与生物量为亲株的2—3倍,40℃生长速率与生物量为亲株HU－TY－1－A的1．3－1．6倍,能够利用淀粉,并且在40℃高温葡萄糖发酵酒精产率比糖化酵母高,比HU－TY－1－A低,是一些有淀粉糖化酶、耐高温的酿酒酵母新菌株。     

酿酒酵母与糖化酵母的种间原生质体融合及其融合子的鉴定

本文报道了酒精生产菌株K氏酿酒酵母Sacchormyces cerevisiae var.ellipsoideus的HUK-1(his-,二倍体,但在我们所试的5种产孢培养基上均不产孢)与糖化酵母Sac—charomyces diastaticus 7c(arg-,a)的种间原生质体融合,其营养标记互补的融合频率约是2．07×10^-6—3．40×10^-5。这些融合子曾在选择培养基MMs或Mmo上连续传代10次,以促进两亲核的融合。融合子的酒精发酵特性,细胞形态、体积大小、DNA含量、繁殖速率、发酵强度以及产孢能力等方面的观察和测定结果表明,均不同于双亲菌株。用显微操作器解剖了个别原养型融台子HU—KDF—185的4孢子子囊,在获得的93个单孢株中,其淀粉发酵特性和遗传标记均有双亲类型的分离或重组现象。上述实验结果充分证明了不同倍性的酵母之间可以通过原生质体融合获得种间杂种。     

酵母属间原生质体融合改进菌株木糖发酵性能

通过单倍体分离和紫外诱变,获得了１４株树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）７１２４和酿酒酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１３００的营养缺陷型突变株。用聚乙二醇（ＰＥＧ）和电诱导融合及致死融合等方法,实现了树干毕赤酵母和酿酒酵母的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生酒精,其厌氧发酵木糖和木糖葡萄糖混合液的能力明显优于亲株,耐酒精的性能也比亲株树干毕赤酵母７１２４有所提高。融合子经ＤＮＡ含量、细胞体积测定和稳定性能实验证明为稳定融合子。     

酵母菌杂交育种IV．高产酒精酵母杂交育种

用显微操作技术进行 Saccharamyces cerevisisae 系 2.576 (mel-)与 S. carlsbergensis 2．500 (MEL+)以及 S．Cerevisisae Stole 系(mel-)与S. microelltpsoides 2.699—2—3(MEL+)种间杂交。获得的杂种能全发酵棉子糖,而亲株只系与Stolc系仅能发酵此糖1／3。两个不同杂交系的杂种H808与H824-14用孢子×孢子交配法进行杂交,所有的杂种酵母H868、H869,H875和H876发酵糖蜜醪比生产菌株日系及Stole系快。H875菌株生成酒精量比其亲株高3一10％。将H875菌株与生产菌株S. cerevisiae DT菌系杂交,获得H946和H948两株杂种,其中H948酒精发酵力比DT系高3％,比H875高2％,是一株酒精生产优良新品系。     

三角酵母二倍体菌株的选育

由三角酵母(Trigonopsis variabilis)原生质体融合,获得了35株原养型融合子。通过对其中四株进行详绌分析表明,融合子细胞体积和DNA含量为两亲株之和,苏木精染色显示单核,这些结果证明融合子为亲株的二倍体。此外,融合子的生长速度、D-氨基酸氧化酶以及细胞蛋白质含量均明显高于亲株。电镜形态观察：进一步证明融合子细胞大于亲株。     

毕赤氏酵母新种——嗜石油毕赤氏酵母D3

该菌是从我国南方豆饼酱中分离出的一株石油酵母。它具有毕赤氏酵母属特征：细胞呈圆形、卵圆形。营养繁殖为多边芽殖,有假菌丝,无真菌丝。子囊孢于呈卵形,光面,不利用硝酸盐,发酵葡菌糖。在麦芽汁中培养易形成白色干燥皱皮膜。此外,它有强嗜石油能力,同化和发酵葡萄糖,弱同化半乳糖和纤维二糖,不同化其他糖类,也不同化核糖、酒石酸,乳酸、琥珀酸、苹果酸,这些与本属的近似种粉状毕赤氏酵母[Pichia farinasa (Lindner) Hansen]不相同,故定为新种——嗜石油毕赤氏酵母D,[Pichia petrophilum Mu sp. Nov. D3]。     

酵母菌属间原生质体融合获得能发酵乳糖生产酒精的融合体

本文报道了用聚乙二醇(PEG)诱导酿酒酵母 （Saccharomyces cerecisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)属间原生质体融合。融合体的细胞体积约为两亲株之和;融合体的DNA含量约为亲株的两倍;融合体具有双亲株的遗传标记。融合体不仅能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖和蜜二糖,而且也能发酵乳糖。在以乳糖为碳源的培养基中,融合体的发酵力是亲株乳酸克鲁维酵母的两倍多;在以葡萄糖为碳源的培养基中,融合体与亲株酿酒酵母的发酵力接近。     

嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

用pUCl8质粒作为载体,将嗜麦芽假单胞菌(Psedeomonas maltophilia P27)的碱性蛋白酶基因克隆到大肠杆菌(E．Coli TGI)中,得到3株能分泌碱性蛋白酶的阳性克隆G1,G2和G3。其中G3所分泌的碱性蛋白酶活性最高,大约是出发菌株的3—4倍,对3株阳性克隆所含的重组质粒psJl,psJ2和psJ3进行限制酶酶切分析表明,酶活最高的阳性克隆G3所含的重组质粒psJ3的插入片段最小,大约是2．8kb;其它两株的重组质粒pSJl和pSJ2含有同样大小的插入片段,约为5．5kb。     

以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型的建立

根据嗜杀酵母T158c/S14a中L-A病毒-1移码效率改变影响M1病毒的存活,导致K1毒素减少,在低pH的美蓝平板上用杯碟法通过抑菌圈的大小检测酵母K1毒素的嗜杀活性,建立了一个以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型。研究了杯碟法检测酵母毒素嗜杀活性的各种条件。对不同pH和温度下酵母的嗜杀活性进行了研究,确定了模型用于筛选的最适pH范围为4.3~4.7,最适温度范围为20~22℃。运用该模型研究了几种中药对嗜杀活性的抑制作用,发现了金银花和升麻具有一定的抗病毒作用。该模型为抗病毒药物的高通量初筛奠定了基础。     

嗜杀酵母KillerYeast的杀伤性质和酵母的病毒假说

嗜杀酵母Killer Yeasf,杀伤酵母或逆戟酵母,是指能释放毒素杀死其同类的酵母。具有杀伤性质的真菌有酵母属(Sac-charomyces),黑粉菌属(Usfflago),吲酵母属(Torulopsfs),德巴里酵母属(Debaromyces),汉逊酵母属(Han-