Viperin蛋白可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联抑制丙型肝炎病毒复制

目前, 对丙型肝炎病毒( HCV) 感染的患者主要采用以Ⅰ型干扰素为主的治疗方案, 但干扰素抑制病毒的具体机制仍然不详。本研究通过实时聚合酶链反应( PCR) 检测HCV的RNA 水平, 蛋白免疫印迹法检测HCV 非结构蛋白的表达, 以及膜飘浮实验检测非结构蛋白与脂筏的关联性, 探讨干扰素诱导蛋白Viperin 抑制HCV 复制的机制。结果显示, 在体外HCV 亚基因复制子( replicon) 及感染细胞模型中过量表达Viperin 可显著降低细胞内HCV 非结构蛋白的表达及RNA 的水平。膜漂浮实验发现, 过量表达的Viperin 可通过干扰HCV 非结构蛋白NS3、NS5A 与细胞内脂筏膜的关联, 使其对非离子去污剂敏感。进一步研究发现, 与脂筏膜结构组成相关的法尼基合成酶( FPPS) 可通过与Viperin 相互作用, 部分反转Viperin 的抗HCV 复制效应。以上结果提出了一种新的干扰素抗HCV 机制, 即干扰素诱导蛋白Viperin 可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联, 干扰HCV 复制复合体的稳定性, 从而抑制HCV 的复制。     

HCV NS5A通过抑制p-AMPK并上调固醇调节元件结合蛋白2及HMG-CoA还原酶促进小鼠肝细胞胆固醇合成北大核心CSCD

已有研究证明,丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可诱导肝细胞脂肪变性。本文报告,HCV NS5A刺激肝细胞胆固醇合成,引起脂代谢失调,促进肝脂肪变性。首先,我们构建了由小鼠甲胎蛋白增强子和小鼠白蛋白启动子驱动的NS5A及NS5A domainⅠ、Ⅱ和Ⅲ的慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后通过尾静脉注射感染小鼠。小鼠血清总胆固醇测定及肝组织切片苏木精-伊红染色揭示,与模拟注射对照及增强绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒颗粒处理小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理小鼠血清总胆固醇水平明显升高;肝细胞内脂滴明显增多。免疫组化和RTq PCR分析显示,胆固醇合成的关键调节酶HMG-CoA还原酶(HMGCR)在NS5A慢病毒处理的小鼠肝内表达显著升高。蛋白质印迹结果证明,与模拟注射及EGFP慢病毒颗粒处理的小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞磷酸化的腺苷一磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)水平明显降低,而固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)及其靶基因HMGCR的水平显著升高。进一步研究发现,NS5A domainⅡ慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞p-AMPK、SREBP-2和HMGCR表达水平与全长NS5A慢病毒处理的小鼠相似。上述结果提示,HCV NS5A蛋白可通过抑制AMPK磷酸化激活,上调SREBP-2而促进胆固醇合成的限速酶HMGCR的表达,从而促进小鼠肝细胞胆固醇合成。上述结果还提示,NS5A domainⅡ可能是全长NS5A蛋白调节HMGCR基因表达的有效片段。总之,本研究证明,HCV NS5A可引起胆固醇代谢紊乱,这可能是慢性HCV感染引起肝脂肪变性的机制之一。很遗憾,在本研究中,尚未测定SREBP-1的靶基因乙酰CoA羧化酶(脂肪酸合成的限速酶)的表达,相关实验正在进行中。     

HCV NS5A通过抑制p-AMPK并上调固醇调节元件结合蛋白2及HMG-CoA还原酶促进小鼠肝细胞胆固醇合成

已有研究证明,丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可诱导肝细胞脂肪变性。本文报告,HCV NS5A刺激肝细胞胆固醇合成,引起脂代谢失调,促进肝脂肪变性。首先,我们构建了由小鼠甲胎蛋白增强子和小鼠白蛋白启动子驱动的NS5A及NS5A domainⅠ、Ⅱ和Ⅲ的慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后通过尾静脉注射感染小鼠。小鼠血清总胆固醇测定及肝组织切片苏木精-伊红染色揭示,与模拟注射对照及增强绿色荧光蛋白(EGFP)慢病毒颗粒处理小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理小鼠血清总胆固醇水平明显升高;肝细胞内脂滴明显增多。免疫组化和RTq PCR分析显示,胆固醇合成的关键调节酶HMG-CoA还原酶(HMGCR)在NS5A慢病毒处理的小鼠肝内表达显著升高。蛋白质印迹结果证明,与模拟注射及EGFP慢病毒颗粒处理的小鼠比较,NS5A慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞磷酸化的腺苷一磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)水平明显降低,而固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)及其靶基因HMGCR的水平显著升高。进一步研究发现,NS5A domainⅡ慢病毒颗粒处理的小鼠肝细胞p-AMPK、SREBP-2和HMGCR表达水平与全长NS5A慢病毒处理的小鼠相似。上述结果提示,HCV NS5A蛋白可通过抑制AMPK磷酸化激活,上调SREBP-2而促进胆固醇合成的限速酶HMGCR的表达,从而促进小鼠肝细胞胆固醇合成。上述结果还提示,NS5A domainⅡ可能是全长NS5A蛋白调节HMGCR基因表达的有效片段。总之,本研究证明,HCV NS5A可引起胆固醇代谢紊乱,这可能是慢性HCV感染引起肝脂肪变性的机制之一。很遗憾,在本研究中,尚未测定SREBP-1的靶基因乙酰CoA羧化酶(脂肪酸合成的限速酶)的表达,相关实验正在进行中。     

丙型肝炎病毒NS5A基因在昆虫细胞中的表达及其分布研究

应用PCR方法从含有丙肝病毒全部非结构蛋白基因的质粒pBAC25中扩增出全长的NS5A基因DNA片段(约1.34kb),PCR扩增NS5A基因片段克隆到转移载体pBlueBacHisA中.重组转移质粒pBlueBacHis5A DNA与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染SF-9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5A基因的重组病AcNS5A.对重组病毒基因组DNA进行酶切和PCR鉴定,证实HCV NS5A基因已插入重组病毒基因组中.AcNS5A感染SF-9细胞后,在细胞中表达出一条64kD的蛋白,用Western-blot分析,结果表明这种蛋白与抗HCV HS5A特异性抗体发生强烈反应,说明NS5A基因已在细胞中得到表达,应用免疫荧光技术与免疫组化技术进一步研究NS5A蛋白在昆虫细胞中不同时间的表达情况及其分布,结果表明,NS5A蛋白在AcNS5A重组病毒感染细胞24h后主要分布在细胞质膜上,而在48h后则同时分布于细胞质膜和细胞核内,在72h则完全布满整个细胞,我们认为NS5A蛋白定位于质膜和细胞核中,暗示着在病毒复制过程中NS5A蛋白可能参与病毒RNA在质膜上复制和细胞基因表达的调控.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2的研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是一种严重危害人类健康的病原体,全球感染率约3％,中国普通人群抗HCV阳性率约3．2％。然而,到目前为止,HCV感染还没有有效的治疗方法。近年的研究发现,HCV非结构蛋白NS2在HCV感染中扮演着重要角色,具有许多重要功能。NS2可以在HCV病毒的包装过程中发挥其功能,还可调节宿主细胞的基因表达及凋亡过程。此外,NS2蛋自还可参与NS5A磷酸蛋白的高度磷酸化修饰过程及为感染性HCV病毒粒子产生所必需。本文综述近几年来关于NS2蛋白的研究进展。     

丙型肝炎病毒NS5A蛋白的生物学调节作用

丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒,基因的编码产物包括10余种结构和非结构蛋白等.NS5A是HCV编码的一种非结构蛋白,在酪蛋白激酶Ⅱ(CK Ⅱ)的催化作用下发生磷酸化修饰.在某些情况下,HCV NS5A的变异与干扰素(IFN)治疗的敏感性有关.NS5A与双链RNA蛋白激酶(PKR)之间的结合不仅与IFN的敏感性有关,而且与感染HCV的细胞发生恶性转化的过程有关.与正常细胞恶性转化有关的机制,还包括NS5A对生长因子受体结合蛋白(Grb2)?接头蛋白、细胞周期及细胞增殖的调节等环节.     

丙型肝炎病毒NS5A基因在昆虫细胞中的表达及其分布研究

应用PCR方法从含有丙肝病毒全部非结构蛋白基因的质粒pBAC25中扩增出全长的NS5A基因DNA片段（约1.34kb),PCR扩增NS5A基因片段克隆到转移载体plueBacHisA中。重组转移质粒pBlueBacHis5ADNA与野生型杆状病（AcNPV)DNA共转染SF-9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5A基因的重组病AcNS5A,对重组病毒基因组DNA进行酶切和PCR鉴定,证实HCV NS5A基因已插入重组病毒基因组中,AcNS5A感染SF-9细胞后,在细胞中表达出一条64kD的蛋白,用Western-blot分析,结果表明这种蛋白与抗HVCHS5A特异性抗体发生强烈反应,说明NS5A基因已在细胞中得到表达,应用免疫荧光技术与免疫组化技术进一步研究NS5A蛋白在昆虫细胞中不同时间的表达情况及其分布,结果表明,NS5A蛋白在AcNS5A重组病毒感染细胞24h后主要分布在细胞质膜上,而在48h后则同时分布于细胞质膜和细胞核内,在72h则完全布满整个细胞,我们认为NS5A蛋白定位于质膜和细胞核中,暗示着在病毒复制过程中NS5A蛋白可能参与病毒RNA在质膜上复制和细胞基因表达的调控。     

表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析

为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3(Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗。体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答。该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+CD4+T细胞亚群。采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护。本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考。     

四环素诱导的丙型肝炎病毒非结构蛋白5B稳定细胞株的构建和检测

丙型肝炎病毒(HCV)感染个体后在宿主细胞内长时间保持低水平复制,与慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌的发生密切相关.目前,HCV感染后肝细胞发生转化的具体机制还不清楚.非结构蛋白5B(NS5B)是HCV编码的非结构蛋白之一,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RdRp),是病毒复制所需的关键酶.除参与病毒复制外,NS5B通过...     

双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子——双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型 PKR真核表达载体（pPKRwt）及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体（pPKRΔ6）,并将pPKRwt /pPKRΔ6 与HCV复制子RNA同时转染Huh7细胞进行共表达, 用Western印迹检测 HCV IRES 下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示：表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.     

HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达

本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该栽体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究.     

HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达

本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该载体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究。     

融合表达DEC205单链抗体和NS3蛋白的HCV DNA疫苗的免疫原性研究

为研发新型HCV DNA疫苗并探讨优化其免疫原性的策略,我们分析靶向树突状细胞(Dendritic cells,DC)的分子对HCV DNA疫苗免疫原性的影响。我们基于抗小鼠DC细胞表面分子DEC205/CD205的单克隆抗体DEC205的单链分子,构建可单独表达DEC205单链抗体或者与HCV非结构蛋白NS3融合表达的DNA表达质粒,并构建单独表达HCV非结构蛋白NS3的DNA表达质粒;经瞬时转染法鉴定HCV NS3及其与DEC205单链抗体融合蛋白的表达;随后采用注射结合电转的方式免疫Balb/C小鼠并研究各疫苗的体液(NS3特异性IgG抗体)与细胞免疫(IFN-γELISPOT)效果。结果表明:DEC205单链抗体基因与HCV NS3编码基因的融合可显著增强NS3特异的免疫应答;采用皮内注射加卡钳电极电转的方式可以产生最强的NS3特异性抗体和T细胞免疫反应。因此,通过DEC205单链抗体与HCV DNA疫苗靶抗原融合可明显增强免疫应答效果。该策略为HCV及其他类似病原的新型DNA疫苗研制提供重要依据。     

HCV NS5A蛋白结构及生物学功能的研究进展

丙型肝炎是丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的,是导致肝硬化和肝癌的主要病因。HCV感染已成为严重危害人类健康的社会公共卫生问题。HCV非结构蛋白5A是近年来HCV抑制剂研究的重要靶点及热点,本文对NS5A的三个结构域以及各个结构域在丙肝病毒复制、病毒颗粒组装及释放方面的生物学功能的研究进展进行了综述,为NS5A抑制剂作用机制的研究提供了广泛的思路,有利于对NS5A抑制剂的研制。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶在酵母系统中的可溶性表达

利用毕赤酵母系统表达具有催化活性的丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白酶 .将PCR直接扩增的病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因和重组的带有辅酶的单链NS3 NS4A蛋白酶基因 ,分别插入表达载体pPICZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ克隆位点 ,转化毕赤酵母GS115 ,可溶性表达NS3蛋白酶和单链NS3 4A蛋白酶 ;ELISA法测定表达蛋白酶的抗原性 ;原核高效表达载体pBVIL1表达酶切底物NS5A B片段 ,体外与蛋白酶共同温育 ,SDS PAGE鉴定蛋白酶催化活性 .载体测序结果表明 ,重组载体pPICZαA NS3和pPICZαA NS3 4A中的目的基因序列插入正确 ;SDS PAGE结果显示 ,培养物上清中存在分泌型目的蛋白带 ;ELISA结果证实 ,表达蛋白与HCV阳性血清有结合活性 ;蛋白酶与底物NS5A B片段不同作用时间的SDS PAGE ,看到约 2 4kD处底物条带的分解 .说明用毕赤酵母表达系统成功地表达了可溶性HCVNS3和单链NS3 4A蛋白酶 ;两种结构形式的蛋白酶在体外系统中都有催化活性 ,同时也都具有抗原性 .该研究为大量和方便地获得有催化活性的HCVNS3蛋白酶提供了有效途径 .     

家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的表达及定位

[目的]在Bm N细胞中表达家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV)非结构蛋白NS1,并分析其亚细胞定位。[方法]在病毒非结构蛋白NS1基因5'端加上kozak序列、3'端融合Flag标签序列;将重组序列克隆至昆虫细胞表达载体pIBV5/His上,转染BmN细胞,通过Western blot和免疫荧光检测NS1蛋白的表达和亚细胞定位。[结果]PCR和酶切鉴定显示重组表达载体构建正确;Western blot检测到一条大小约37 kDa的特异条带,免疫荧光分析显示表达的蛋白主要定位于细胞核中。[结论]构建的真核表达质粒能在BmN细胞中稳定表达NS1蛋白,该蛋白主要定位在细胞核中。     

LXR-alpha/SREBP-1c通路参与HCV NS5A诱导的肝细胞脂质代谢紊乱

肝细胞脂肪变性是丙型肝炎患者的突出病理特征,但丙肝病毒（HCV）诱导脂肪变性的分子机制尚不清楚.为探究HCV非结构蛋白5A（NS5A）参与诱导脂肪变性的可能分子机制,本研究以HCV NS5A转基因小鼠为研究对象,采集3～16月龄NS5A转基因小鼠和同窝非转基因小鼠的肝组织,进行病理学检测,并用气相色谱 质谱（GC-MS）法分析脂质主要成分胆固醇酯的含量.采用RT-PCR法检测肝细胞中与脂质代谢密切相关基因肝X受体（LXR-alpha）、固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）、过氧化物酶体增殖物受体alpha（PPAR-alpha）的mRNA表达水平.结果表明,与同窝非转基因对照小鼠相比,3～5月龄NS5A转基因小鼠的肝组织没有发生显著的病理性变化,但6～16月龄的NS5A转基因小鼠的肝脏发生了显著的脂肪变性（47.1% vs 130%;P=0.003）.与此相一致,胆固醇酯的含量在NS5A转基因小鼠的肝脏中显著升高（P < 0.01）.RT PCR检测结果表明,与对照小鼠相比,14月龄NS5A转基因小鼠肝组织中与脂质代谢相关的基因LXR.alpha、SREBP.1c、FAS、SCD1的mRNA表达水平显著增高（P < 0.05）,而PPAR alpha的表达则没有显著变化（P > 0.05）. 以上结果提示,NS5A在小鼠肝细胞中可能通过调高LXR.alpha/SREBP.1c信号通路相关基因的表达,进而促进脂质重新合成,诱导脂肪变性.     

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件。使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的pET-30a载体中;转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。用抗HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定。结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白。测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69％-92．7％及88．8％-96．8％之间。在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18．9％。Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶。HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B抑制IFN介导的抗病毒反应

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)非结构蛋白NS4B的功能仍不很清楚。本实验旨在研究NS4B对干扰素介导的抗病毒反应的影响。建立稳定表达NS4B的细胞系后,用空斑实验研究NS4B在不同浓度的IFN_α下对水泡口炎病毒(VSV)的影响,利用代表2308个信号传导相关的基因的微点阵研究其对细胞基因表达的影响,和流式细胞仪分析IFNGR1的荧光强度。结果显示HCV_NS4B能微弱地抑制IFN_α介导的抗病毒反应,可能原因是HCV_NS4B抑制一些与免疫反应相关的基因的表达,特别是与IFN_γ信号传导有关的基因。因此,NS4B对HCV耐受干扰素治疗起一定的作用。     

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件.使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI 和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的 pET-30a载体中;转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用抗 HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定.结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白.测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69%～92.7%及88.8%～96.8%之间.在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18.9%.Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶.HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型奠定了基础.