土壤宏基因组文库来源酯酶的鉴定与表征

【目的】利用宏基因组学技术挖掘土壤微生物来源的新型酯酶。【方法】构建土壤微生物宏基因组文库,利用三丁酸甘油酯平板法对所构建的文库进行筛选,并对阳性克隆中鉴定出的酯酶基因进行异源表达和生物化学特性分析。【结果】通过筛选文库中的12万个克隆,获得了一个阳性克隆,对克隆中的DNA片段进行序列分析,发现了一个可能的酯酶基因,通过研究其表达产物,确定其最适pH为9.0,最适反应温度为56°C,在90°C下仍可保持20%的酶活性;能专一性水解短链脂类,对长链脂类无水解作用;对一定浓度范围内的有机试剂如二甲基亚砜、甲醇、乙醇有较好的耐受性,尤其当二甲基亚砜含量为10%(体积比)时,相对酶活可提高44%。【结论】不依赖于微生物可培养性的宏基因组学技术可以发现新的活性酶,本研究获得的对高温、有机试剂有较好耐受性的酯酶ESTYN1具有在工业生产中应用的潜力。     

红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物Fosmid文库,共获得了约100 000个阳性克隆,该文库外源插入片段平均长度约为30 kb,文库容量达3 Gb。通过对文库中10 000个克隆进行功能筛选,获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆,获得2个新颖的β-葡萄糖苷酶的基因,分别命名MhGH3和bgl66。生物信息学分析表明,MhGH3基因由1 992个碱基对组成,bgl66基因由2 025个碱基对组成。在氨基酸水平上,MhGH3和bgl66编码的蛋白质与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分别为64%和55%。     

高糖土壤微生物宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因鉴定

采用宏基因组技术构建了高糖土壤微生物的DNA文库,该文库约含9万个克隆,文库外源DNA总容量为3.1×10~9bp。利用活性筛选策略,对文库进行筛选,获得11个β-葡萄糖苷酶的阳性克隆,并对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆和序列分析,获得两个编码新型β-葡萄糖苷酶的基因分别命名为:unbgl3A和unbgl3B。生物信息学分析表明:unbgl3A基因由2241个碱基对组成,unbgl3B基因由2292个碱基对组成。在核苷酸水平上,unbgl3A、unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上,与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的相似性分别为73%和69%。     

粪便宏基因组来源低分子量碱性β-半乳糖苷酶的异源表达及酶学性质

【背景】β-半乳糖苷酶在食品加工、临床医疗及基因工程等领域有重要的应用价值,开发酶活性高、热稳定性强的β-半乳糖苷酶已成为研究热点。【目的】从西黑冠长臂猿（Nomascus concolor）粪便微生物宏基因组中挖掘新型β-半乳糖苷酶并进行酶学性质研究。【方法】以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板扩增β-半乳糖苷酶基因GalNC1-8,构建重组表达质粒pEASY-E2/GalNC1-8,转化至大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）异源表达,研究其酶学性质。【结果】获得GH35家族碱性β-半乳糖苷酶GalNC1-8,其分子量为28.18 kDa,最适温度为50°C,最适pH为8.0。将该酶在30-50°C下处理1 h,剩余酶活仍保持在80%以上;pH 7.0-9.0下处理1 h,剩余酶活大于54%。在含乙醇的反应体系中,其酶活性几乎不受影响;β-巯基乙醇、丙三醇、甲醇、Na⁺、K⁺和Li⁺对其酶活性有促进作用。在0.5-3.5 mol/L NaCl下处理1 h后,仍保留50%以上的酶活性。...     

滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶基因的表达及酶学性质

【目的】对滇金丝猴粪便微生物来源的β-半乳糖苷酶进行异源表达和纯化,并研究其酶学性质。【方法】从滇金丝猴粪便微生物的宏基因组中克隆出一个β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,对该基因进行异源表达和酶学性质分析。构建含有T7强启动子的pEASY-E2-galRBM20_1质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行酶学性质研究。【结果】滇金丝猴粪便来源的β-半乳糖苷酶(galRBM20_1)最适pH为5.0,在pH 4–7之间能保留70%及其以上的活性。最适温度为45°C,在37°C和45°C下耐受1 h,酶活不变。特别的是,该酶具有良好的Na Cl稳定性,经1–5 mol/L的Na Cl作用1 h后,相对酶活均能超过初始酶活:当NaCl的作用浓度为4 mol/L时,β-半乳糖苷酶相对酶活最高(146%);当NaCl的作用浓度为5mol/L时,β-半乳糖苷酶的相对酶活仍达到135%。【结论】本研究从滇金丝猴粪便微生物的宏基因库中克隆得到β-半乳糖苷酶基因galRBM20_1,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)表达,首次从动物胃肠道宏基因组中获得具有耐盐和转糖基产Galactooligosaccharides(GOS)性能的β-半乳糖苷酶。该酶具有良好的耐盐性,和较广的pH作用范围,使其在食品、生物技术领域和环保方面的发展具有良好的应用价值。     

源于红树林土壤宏基因组文库的新型磷脂酶A1基因的筛选、克隆表达及酶学性质

【目的】利用宏基因组学的方法从红树林土壤中筛选新型酯水解酶类。【方法】构建红树林土壤宏基因组文库,采用以三丁酸甘油酯为底物的功能筛选方法,对筛选出的阳性克隆进行系统发育树分析,实现新型磷脂酶A1基因的原核表达,研究重组酶的酶学性质。【结果】筛选到一个新的磷脂酶A1编码基因phop1413 (GenBank登录号KF767097),测序表明其全长1 413 bp,可编码470个氨基酸残基,表达蛋白约51.7 kD,表达量高达220 mg/L,NCBI中Blast比对及系统进化树分析显示该蛋白属于磷脂酶类的fAMILY Ⅵ家族;酶学性质分析表明,该重组酶的最适反应底物为对硝基苯酚己酸酯,比酶活为124 U/mg;最适反应温度为54 °C,最适pH 7.8;50 °C热处理1.5 h剩余相对酶活为44%,表现出很好的热稳定性。【结论】通过构建宏基因组文库利用功能筛选方法获得一个新型磷脂酶A1基因;研究中获得的新型磷脂酶A1性质较好,可用于植物油酶法脱胶。     

甲硫氨酸γ-裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性

【背景】为了开发海洋蕴藏的新型微生物资源,本研究团队采用不依赖培养的宏基因组技术,构建了深海宏基因组文库,并对其中的重要基因进行后续研究。【目的】使用来自深海宏基因组文库中的甲硫氨酸γ-裂解酶基因(mgl)在大肠杆菌中高效表达并对其活性进行检测。【方法】将mgl基因克隆到表达载体pET-28a(+)并转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并对表达条件进行优化,获得甲硫氨酸γ-裂解酶(Methionine-lyase,r MGL)的大量表达。亲和层析纯化重组蛋白后对酶的活性进行研究。【结果】亲和纯化后获得大量表达蛋白r MGL,大小与预测的46 kD相符合,并具有很高的裂解L-甲硫氨酸的活性。r MGL能催化L-甲硫氨酸和DL-同型半胱氨酸的裂解,但几乎不作用于L-半胱氨酸和L-胱氨酸,其中对DL-同型半胱氨酸的催化效率比对L-甲硫氨酸的催化效率高,相对活性约为对L-甲硫氨酸催化效率的1.4倍。【结论】来自深海宏基因组文库中的mgl基因能够利用p ET-28a(+)/BL21(DE3)高效表达r MGL。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G 的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶.本工作分 6 次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得 1.26×105个克隆,文库含外源 DNA 的总长度约为 4.8×106kb.从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆.发现其中 8 个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强.对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个 2223 bp 的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有 60%的一致性和73%的相似性.该ORF在 E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因.测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G 的酶学特性,其最适 pH 和最适温度分别为 6.0～6.5 和 45℃.一些金属离子如 Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如 Fe3+、Cu2+能抑制 Umcel3G 的活性.在 pH4.5、35℃和 5 mmol/L 的 Ca2+存在的条件下,用 Ni-NTA 纯化的重组酶的比活为 22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值.     

沼气池宏基因组文库中未培养微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定

以间接提取法提取了沼气池样品的微生物宏基因组DNA,用柯斯质粒载体pWEB:TNC构建了一个含三万个克隆的沼气池宏基因组文库,对文库中的克隆随机分析表明,该文库的外源片段平均长度为40 kb,文库的总容量为1 .2×106kb。对其中的一个在七叶苷平板上显色的阳性克隆pGXN100进行进一步亚克隆、测序和序列分析。结果表明,pGXN100上有一个全长为1 863bp的ORF,编码621个氨基酸组成的蛋白质。将该基因命名为Unglu100。与产气克雷伯菌属的一个β-葡萄糖苷酶基因AN292在核苷酸和氨基酸水平上分别有76%和85%的同源性,利用SMART软件进行预测表明,Unglu100可能是PTS中β-葡萄糖苷酶特异性的转运蛋白组件。     

牙菌斑培养菌群宏基因组文库构建及抗生素耐药基因筛选

[目的]构建牙菌斑培养菌群宏基因组文库,筛选牙菌斑生物膜中细菌的抗生素耐药基因.[方法]采集20例无龋健康人的集合牙菌斑并进行厌氧培养.提取牙菌斑培养菌群宏基因组构建Fosmid文库.用卡那霉素、四环素及氨苄西林对文库进行筛选,并对筛选到的抗性Fosmid克隆进行末端测序、亚克隆构建、亚克隆测序和序列分析.[结果]构建了牙菌斑培养菌群宏基因组Fosmid文库,插入片段长度在36-48 kb间约有15 120个克隆,插入片段长度小于36 kb的约有3 360个克隆.筛选获得一个氨基糖苷类双功能修饰酶AacA-AphD基因、一个核糖体保护蛋白型四环素耐药基因tet (M)及一个C家族β-内酰胺酶基因.[结论]证实了可以通过构建宏基因组文库的方法来筛选牙菌斑培养菌群中的抗生素耐药基因.     

从植物共生菌宏基因组文库筛选新的生物催化酶基因

【目的】通过建立宏基因组文库的高通量保存与基于探针洗脱的多次膜杂交筛选方法,从植物共生菌宏基因组文库筛选具有生物催化潜力的新酶基因。【方法】首先根据滴度将初始文库噬菌体包装颗粒感染到EPI300-T1R E.coli,过夜培养后对应保存于96孔板;提取粘粒进行文库的杂交筛选。【结果】描述的洗脱条件可完全去除尼龙膜上与靶DNA结合的探针,并且尼龙膜上的靶DNA至少可用于7次探针杂交,从而明显提高宏基因组文库的筛选效率。【结论】以Enoate reductase(ER)和短链脱氢酶(SDR)的同源基因片段为探针,运用该方法经两轮筛选获得候选单克隆并进行了部分粘粒的测序,发现了新的ER和SDR同源基因,并克隆到相应的全长基因序列用于后续的表达与酶化学研究。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

嗜热淀粉芽孢杆菌来源β-葡萄糖苷酶的重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase),是纤维素分解酶系中的重要组成部分,目前工业上应用的β-葡萄糖苷酶多数来源于植物和真菌,来源于细菌的较少,且应用中还存在酶活力偏低、热稳定性差、反应条件适用范围窄、酶活力易受产物反馈抑制等问题,增加了经济成本。嗜热微生物具有特殊的遗传信息资源,极有可能从中挖掘到酶学性质优良的新型β-葡萄糖苷酶,从而解决工业难题。【目的】从嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷酶基因,通过基因重组、异源表达和蛋白纯化技术制备新型β-葡萄糖苷酶,并探究其酶学性质,为新型β-葡萄糖苷酶在纤维素水解等领域的应用奠定基础。【方法】人工合成新型β-葡萄糖苷酶基因bgl52,构建重组表达质粒pET22b-bgl52,并用电脉冲法转化到大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到高纯度的β-葡萄糖苷酶Bgl52。【结果】实现重组表达质粒pET22b-bgl52在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达,并获得β-葡萄糖苷酶Bgl52纯蛋白,蛋白分子量为52 kD,在70°C和pH 6.5条件下表现出最佳活性;以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p NPG)为底物时的比酶活为223.7±5.3 U/mg;K_m为9.3±1.2 mmol/L,V_(max)为270.3±4.3μmol/(min·mg);Bgl52偏好性水解β-1,4糖苷键的底物;Fe~(2+)和Mg~(2+)对酶的激活作用明显,Co~(2+)、Cu~(2+)和SDS可抑制其活性;Bgl52是少有的几种葡萄糖和木糖激活型β-葡萄糖苷酶之一,当反应体系中外源添加0.2 mol/L葡萄糖时可提升活力至2.84倍,外源添加0.4 mol/L木糖时可提升活力至3.24倍,同时Bgl52在生理条件下基本不受产物的反馈抑制。【结论】利用嗜热微生物基因组中蕴藏的遗传信息资源,通过现代生物技术方法,可以从中挖掘到酶学性质优良的β-葡萄糖苷酶,为其在纤维素降解等工业领域的应用奠定基础。     

温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选

【目的】本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库,以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因。【方法】采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总DNA,经平末端、连接、包装、转染后,构建宏基因组Fosmid文库,同时,以脱脂奶为底物,以根结线虫为靶标,对文库进行功能初筛。【结果】该文库库容31008个克隆,平均插入片段36.5kb,包含1.13Gbp的微生物基因组信息,适合大规模的微生物功能基因筛选,通过功能初筛,筛选到1个含杀线虫蛋白酶基因的Fosmid克隆(pro12)。进一步构建和筛选出亚克隆(espro124a5),通过对基因结构进行了初步分析发现:espro124a5是一种分泌型胞外蛋白酶,与来自于Maricaulis maris MCS10(accession no.YP_756822at NCBI)的丝氨酸蛋白酶S15仅有45%的同源性,是一种新型的丝氨酸蛋白酶,有其保守的催化三元组:Asp469、His541和Ser348。【结论】密度梯度离心法提取到的DNA纯度高、片段长,完全能满足构建宏基因组Fosmid文库的要求;同时,构建的宏基因组Fosmid文库库容大,有利于我们从中筛选其他的微生物基因资源。     

造纸废水纸浆沉淀物中未培养微生物纤维素酶基因的克隆和鉴定

提取纯化造纸废水纸浆沉淀物的宏基因组DNA并构建16S rDNA文库,系统发育分析显示该环境中存在大量的未培养细菌且具有种类的多样性。以柯斯质粒为载体构建了1个含10000个克隆的宏基因组文库,文库容量为3.53×108bp。筛选文库得到2个表达内切葡聚糖酶活性的克隆、3个表达外切葡聚糖酶活性的克隆和2个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆。从表达不同活性的克隆中分别挑选活性最强的进行鉴定,得到3个新的纤维素酶基因umcel5L、umcel5M和umbgl3D。umcel5L、umcel5M和umbgl3D分别编码产生内切葡聚糖酶、纤维糊精酶和β-葡萄糖苷酶,其编码产物与已报道的纤维素酶一致性最高的分别为43%、48%和46%。这是第一次采用未培养方法对造纸废水纸浆沉淀物中的细菌多样性进行分析并从中克隆纤维素酶基因的报道。     

粪便微生物宏基因组来源GH1 β-葡萄糖苷酶的重组表达及酶学性质

[背景] β-葡萄糖苷酶是一类重要的纤维素分解酶类。目前较多可培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶（Bgl）存在热稳定性和酸碱稳定性差及作用范围窄的问题。[目的] 从滇金丝猴粪便微生物宏基因组中挖掘新型β-葡萄糖苷基因,异源表达并研究其酶学性质,为食品等领域提供新型酶资源。[方法] 从粪便微生物宏基因组出发,扩增和异源表达β-葡萄糖苷酶基因BglRBS_26和BglRBS_9,并进行酶学性质研究。[结果] 获得GH1家族重组β-葡萄糖苷酶BglRBS_26和BglRBS_9,分子量分别为60 kD和50 kD。BglRBS_26的最适作用条件为pH 6.0、45 ℃;BglRBS_9的最适作用条件为pH 5.0、40 ℃。BglRBS_26和BglRBS_9的K_m分别为0.681 6±0.164 2 μmol/L和3.317 0±0.871 4 μmol/L。BglRBS_26具有较好的酸碱耐受性,在pH 5.0–6.0下处理1 h,剩余酶活大于110%;pH 7.0-8.0范围内,剩余酶活仍然保持在100%以上。此外,蔗糖对BglRBS_26和BglRBS_9有不同程度的激活,当反应体系中加入20%（质量体积分数）蔗糖,BglRBS_26酶活力可提高至140%;10%（质量体积分数）蔗糖可将BglRBS_9酶活力提高至180%。此外,BglRBS_26具有较好的NaCl耐受性和稳定性,其在37 ℃、2.5 mol/L的NaCl下处理1 h后保留80%活性。[结论] 从滇金丝猴粪便微生物宏基因组中获得2个新型β-葡萄糖苷酶基因BglRBS_26和BglRBS_9,并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。BglRBS_26和BglRBS_9具有较好的pH稳定性和蔗糖耐受性,在食品、发酵等行业具有潜在应用价值。     

宏基因组学挖掘新型生物催化剂的研究进展

微生物蕴藏着大量具有工业应用潜力的生物催化剂。然而,传统培养方法只能从环境中获得不到1%的微生物。宏基因组学是通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库并对文库进行筛选,寻找和发现新的功能基因的一种方法。它绕过了微生物分离培养过程,成为研究环境样品中不可培养微生物的有力手段。因此,从宏基因组中挖掘新型生物催化剂一直倍受生物学家的关注。以下主要对宏基因组文库的样品来源、DNA提取方法、文库的构建和筛选策略的选择这4个方面的研究状况进行了综述,列举了近年来利用宏基因组技术所获得的新型生物催化剂,并对其今后的研究方向提出了展望。     

深海沉积物微生物元基因组文库来源的新的酯酶基因的克隆、表达及酶学性质

【目的】从深海沉积物微生物元基因组文库中克隆新的酯酶基因,并进行酶学性质研究。【方法】利用含有三丁酸甘油酯的酯酶选择性筛选培养基,从深海沉积物微生物元基因组文库中筛选得到酯酶阳性Fosmid克隆。对筛选得到的fosmid FL10进行部分酶切构建亚克隆文库,筛选得到酯酶阳性亚克隆pFLS10。PCR扩增目的片段后与pET28a连接构建酯酶基因原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。纯化表达产物并对其进行活性测定及酶学性质研究。【结果】序列分析显示该pFLS10亚克隆质粒含有一段924bp的ORF(Open Reading Frame),与一海洋元基因组文库中筛选出的酯酶ADA70030序列一致性为71%。该酶为一新的低温酯酶,对C4底物(对硝基苯丁酸酯)水解能力最强。该酶最适作用温度为20℃,最适作用pH为7.5,20℃时较为稳定,pH8-10的范围内有良好的pH稳定性,K+、Mg2+对该酶具有一定的激活作用,Mn2+等对其具有不同程度的抑制作用。【结论】应用元基因组技术筛选到了新的酯酶基因fls10并进行了克隆表达,该酶在低温及碱性条件下较为稳定且活力较高,对于工业化生产具有一定的应用潜力。关键词:深海沉积物;元基因组文库;低温酯酶;酶学特征