粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

滇金丝猴粪便微生物GH10家族木聚糖酶基因多样性

【目的】分析滇金丝猴粪便微生物中GH10家族木聚糖酶的基因多样性。【方法】以野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,用GH10木聚糖酶简并引物扩增木聚糖酶基因片段,利用p MD19-T载体构建细菌克隆文库并进行分析。【结果】从野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物克隆文库中分别获得26、28条GH10木聚糖酶基因片段,与Gen Bank中木聚糖酶序列一致性分别介于58%-95%、63%-81%之间。比对分析表明,两种环境中的GH10木聚糖酶均来自厚壁菌门、拟杆菌门和未培养细菌。野生滇金丝猴粪便微生物的GH10木聚糖酶基因来源于Uncultured bacterium和Butyrivibrio、Bacteroides、Ruminococcus、Sphingobacterium、Chryseobacterium、Clostridium、Bacillus 7个属;而半圈养滇金丝猴粪便微生物的GH10木聚糖酶基因来源于Uncultured bacterium和Clostridium、Paludibacter、Sphingobacterium、Ruminococcus、Roseburia、Chryseobacterium 6个属,其中两种环境都存在来源于Ruminococcus、Clostridium、Chryseobacterium、Sphingobacterium的GH10木聚糖酶。【结论】滇金丝猴粪便微生物中含有丰富的GH10木聚糖酶基因,且野生和半圈养两种不同环境中GH10木聚糖酶基因的微生物来源存在一定差异。该研究丰富了动物胃肠道中GH10木聚糖酶基因多样性,并为新型木聚糖酶的开发和滇金丝猴胃肠道微生物资源的利用奠定了基础。