包含体的体外复性研究进展

在大肠杆菌中大量表达的重组蛋白质常常形成无活性的、不溶性的包含体。包含体经过液固分离、洗涤、变性溶解后,经过一个合理的复性过程可重新折叠成有活性的蛋白质。本文概述了常用的包含体复性方法,并对近年来出现的色谱复性法和应用一些低分子量添加剂等来提高蛋白质复性的产率做了简述。     

重组蛋白包涵体的复性研究

重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往形成不可溶、无生物活性的包涵体,需经过变性溶解后,在适当条件下复性形成天然的构象,才可恢复其生物活性．变复性实验是建立在对蛋白质体外折叠机制的了解的基础上．根据近年来对蛋白质折叠机制的认识和重组蛋白包涵体在复性方面的主要进展,论述以下3个方面的内容：1)蛋白质在细胞内的折叠机制;2)蛋白质体外折叠机制;3)蛋白质复性的策略和方法．     

包含体蛋白质的复性研究进展

包含体的形成是异源蛋白质在大肠杆菌中高效表达的必然结果,也是目前产生重组蛋白质最有效的方法之一。不可溶、无生物活性的包含体必须经过变性、复性才能获得天然结构,完整特定的生物学功能。聚集是造成重组蛋白质复性产率低下的主要因素,因此理解蛋白质聚集机制,减少和防止聚集的发生是建立高效、高产率复性方法的关键。分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。     

包含体的体外复性策略

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体即包含体。包含体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包含体中复性重组蛋白。介绍稀释法、透析及分子排阻、固定化金属离子亲和层析、疏水层析复性等策略和进展;物理化学因素、前导肽协助蛋白折叠;人工分子伴侣辅助蛋白折叠及反胶束、多聚物用于蛋白复性。     

重组包涵体蛋白质的折叠复性

综述了减少包涵体形成、包涵体分离和溶解以及包涵体折叠复性的策略及其最新进展 .详细讨论了包涵体蛋白质折叠复性的基本原则、包涵体折叠复性促进剂和包涵体折叠复性方法     

蛋白质复性技术研究进展

评述了蛋白质复性研究的科学背景及蛋白质折叠机制的研究现状,详细介绍近年来蛋白质复性技术的研究进展,包括稀释添加技术和各种辅助因子的作用、固定化辅助因子应用、尺寸排阻色谱和固定化辅助因子色谱等。     

Hofmeister效应与包含体的变性和复性

Hofmeister效应反映了溶质小分子通过与水分子的相互作用, 对蛋白质等生物大分子造成的结构上的影响.通过对此效应的深入研究, 可以从理论上解释许多常见的生理生化现象.蛋白质的变性、复性问题是与Hofmeister效应密切相关的生化基础课题. 目前重组蛋白生产过程中包含体的变性和复性问题为上述理论研究提供了广泛的应用空间.     

蛋白质复性技术研究进展

评述了蛋白质复性研究的科学背景及蛋白质折叠机制的研究现状 ,详细介绍近年来蛋白质复性技术的研究进展 ,包括稀释添加技术和各种辅助因子的作用、固定化辅助因子应用、尺寸排阻色谱和固定化辅助因子色谱等。     

包涵体蛋白的层析复性技术研究进展

包涵体蛋白的复性是生物工程下游技术中的一个重要难题。层析法用于蛋白质复性是一种较新的、适用于大多数蛋白的方法。其原理是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化,使变性蛋白质在层析柱上重折叠为正确的空间构象,在洗脱的同时实现部分纯化。本文详细介绍了蛋白质在5种层析柱上的复性方法、原理、应用及研究的新进展,为层析法对蛋白质复性的进一步应用提供依据。     

精氨酸、精氨酸盐酸、半胱氨酸、胱氨酸对重组人tPA蛋白复性的影响

以重组人tPA蛋白为材料研究了精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸对蛋白质复性效果的影响,重组tPA蛋白包涵体经尿素变性溶解后,在精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸存在的条件下进行复性,结果表明,碱性的精氨酸在质量分数0.2%时可减少蛋白质凝聚,显著提高复性效果,tPA复性后的活性可提高50%以上,半胱氨酸单独使用具有类似β-巯基乙醇的作用,精氨酸盐酸盐和胱氨酸单独使用对复性无影响,而半胱氨酸和胱氨酸联合使用,有类似氧化-还原系统作用。可提高活性20%。     

蛋白质层析柱复性及工艺评价

蛋白质复性工艺的研究一直是重组蛋白药物研发领域的热点。稀释复性法和透析复性法的蛋白损失较大、复性得率不理想,而层析柱可以完成复性同时纯化,并能在高蛋白浓度条件下得到较高的复性率,有利于规模放大,是近年来最受关注的复性工艺。就层析柱复性工艺进行了归纳,包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析的复性,并对其复性原理及各自的优缺点进行了比较分析,最后从复性工艺的有效性、优越性以及对于规模化生产的适用性三个角度论述复性工艺的评价方法。     

蛋白质复性

重组ＤＮＡ技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径。但人们在分离纯化基因工程表达产物时却遇到了意想不到的困难 :很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素 6、人γ 干扰素等 ,不仅不能分泌到细胞外 ,反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约 0 .1～ 3.0 μｍ的固体颗粒———包含体[1] 。这些基因表达产物的一级结构 (即氨基酸序列 )虽然正确 ,而其立体结构是错误的 ,所以没有生物活性。因此 ,为获得天然状态的目标产物 ,必须在分离回收包含体后 ,溶解包含体并设法使其中的目标蛋白质…     

效应与包含体的变性和复性

Ｈｏｒｍｅｉｓｔｅｒ效应反映了溶质小分子通过与水分子的相互作用,对蛋白质等生物大分子造成的结构上的影响。通过对此效应的深入研究,可以从个解释许多常见的生理生化现象。蛋白质的变性、复性问题是与Ｈｏｒｍｅｉｓｔｅｒ效应密切相关的生化基础课题。目前重组蛋白生产过程中包含的变性和复性问题为上述理论研究提供了广泛的应用空间。     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

大肠杆菌表达的重组hIL-4的分离纯化

对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 4进行了分离纯化。人 IL- 4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在 ,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理 ,可使包含体纯度达 70 %以上 ,用 6mol/L盐酸胍变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性 ,再经浓缩、透析、离子交换色谱一系列纯化步骤终产物纯度达 95 %以上 ,回收率 1 0 %以上 ,比活性达 2 .5× 1 0 6U/mg     

蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展

外源基因在大肠杆菌中表达后常形成不溶性的无活性包涵体。包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍。然而,在合适的条件下,包涵体经过溶解、纯化、复性过程后可在体外重新折叠成有活性的蛋白质。迄今,已对蝰科、眼镜蛇科11种毒蛇的18个基因(包括金属蛋白酶、PLA₂、β-银环蛇毒素、心脏素素、丝氨酸蛋白酶、神经生长因子、C-型凝集素等)成功进行了原核表达,采用稀释复性、透析复性和层析复性三种方法成功进行了包涵体复性。着重就蛇毒蛋白原核表达后包涵体复性所用的方法予以综述。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展

重组蛋白在大肠杆菌中表达多为无活性的包涵体形式,须经洗涤、溶解、复性后才能得到生物活性蛋白。综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和复性技术研究进展,重点讨论了色谱法复性技术的应用,包括尺寸排阻色谱、亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化脂质体色谱、扩张床吸附色谱的进展情况。     

凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)中的应用

将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)基因,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA\|32K分子较大并且表达量较高,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质,为了获得有活性的蛋白质,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法,具有成本低,效率高,并对目的蛋白质(DscuPA\|32K)进行了初步纯化等优点,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时,很值得进行推广应用。     

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的稀释复性

N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶（N-Acetylornithine deacetylase,NAO）是一种重要的用于手性拆分的酶,具有广泛的底物选择性,常用于多种活性氨基酸的酶法拆分。采用稀释复性法研究了重组NAO包涵体的复性条件,如蛋白浓度、复性液中尿素浓度、pH、GSH浓度及c（GSH）/c（GSSG）比例,同时对稀释操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件。结果表明,尿素能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,随着蛋白质浓度的增加,复性效果变差。当复性缓冲液中尿素浓度为2 mol/L,GSH浓度为5 mmol/L,c（GSH）/c（GSSG）为2.5,pH为8.5,在4℃下进行分批稀释复性操作,复性后重组NAO的活性为1.077 U/mL,比酶活达到14.943 U/mg,与可溶性表达的NAO比较,复性率达到21.48%。