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分离去除高丰度蛋白成为血浆蛋白质组研究的关键问题之一。我们从已建株的17株抗人血浆白蛋白单克隆抗体库中选出一株合适抗体。该抗体用Protein G Sepharose 4B吸附,然后用交联剂DMP(Dimethyl pimelinediimidate chloride)使之与Protein G 蛋白共价交联。实验结果显示600µL(结合1mg抗体)胶能分离10µL血浆中的白蛋白和球蛋白。填料进行重复使用10次后吸附能力变化无显著改变。对填料的吸附蛋白进行MALDI-TOF/TOF 鉴定主要为白蛋白和球蛋白,及其碎片,但发现吸附的蛋白有转铁蛋白,纤维蛋白原,抗胰蛋白酶,前脂蛋白,Vitamin D 结合蛋白,Keratin 10和 CD5 antigen like蛋白。实验结果表明该方法能在固定目的抗体同时最大量地保持抗体活性,该方法有望在蛋白质组学研究的高丰度蛋白分离中得到广泛应用。 相似文献
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[目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定后,三质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,收集且浓缩病毒毒液用于感染人胃癌MKN45细胞并筛选稳定细胞株,用Western Blot验证。[结果]成功构建慢病毒重组质粒N2ICD/pLV;包装病毒后,荧光显微镜下观察到大部分HEK293T细胞发出绿色荧光;收集病毒毒液感染MKN45细胞,显微镜下观察有部分细胞表达绿色荧光蛋白;流式分选技术筛选得到稳定细胞株,Western Blot鉴定结果显示:相比于空白对照组,稳定株的N2ICD过表达明显。[结论]成功构建慢病毒表达质粒N2ICD/pLV,并建立稳定过表达N2ICD的胃癌细胞株N2ICD/pLV-MKN45。 相似文献
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人血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因组包括6个外显子和5个内含子,内含子在其表达过程中可能扮演着重要作用.为了研究人TPO基因组中不同内含子对TPO表达的影响,构建可在转基因动物乳腺中高水平表达人TPO的乳腺特异性表达质粒.本研究以65 kb的山羊β-casein启动子为调控元件,构建了包括人TPO cDNA(pTPOA)、TPO intronⅠ-TPO cDNA (pTPOB)、ΔTPO intronⅠ-TPO cDNA (pTPOC)、TPO intronⅤ-TPO cDNA (pTPOD)和TPO gDNA (pTPOE)等5种TPO乳腺特异性表达质粒,并在人乳腺细胞HC-11细胞上进行了瞬间表达研究.在转染48 h后,通过双抗体夹心的ELISA方法定量分析上述质粒在HC-11细胞上的表达水平.结果表明,含有内含子Ⅴ的 pTPOD的表达量最高,而含有整个基因组TPO的pTPOE表达水平最低.为了进一步证实pTPOD可在乳腺细胞中高水平表达,将pTPOD经脂质体包埋后注射到泌乳期山羊的乳腺中.结果显示,在山羊乳汁中可连续14 d检测到人TPO的表达.上述实验证实,人TPO基因组中的内含子V可显著提高TPO在HC-11细胞内的表达水平,并提示内含子Ⅴ中可能含有特殊的调控序列. 相似文献
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