利用Site-Finding PCR克隆琼胶酶基因

目的：新型琼胶酶基因的筛选。方法：根据α-琼胶酶基因序列的同源性,设计了兼并引物,利用兼并PCR对所筛选到的琼胶酶产生菌株进行筛选,阳性菌株进行16s rDNA序列测定并构建了进化树。利用染色体步移技术Site-finding PCR获得目的基因的上下游序列,经过拼接获得全长的目的基因序列,并利用Blast对其进行分析。将目的基因插入pET 24a（＋）载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用平板水解圈初步鉴定了重组酶的性质,并利用DNS法检测了重组酶发酵上清液的酶活。结果：获得了一株疑似α-琼胶酶产生菌株,16s rDNA序列鉴定显示为Thalassomonas sp.,命名为Thalassomonas sp.LD5。获得了一个新的基因,命名为agaD。agaD开放阅读框长4401 bp,编码1466个氨基酸,理论分子量为158.8kDa。序列分析表明,agaD编码的蛋白AgaD与已有的两种α-琼胶酶的相似性分别为89%和77%。重组AgaD经诱导后可以直接降解琼胶平板产生水解圈,其发酵上清液酶活为0.2 U.ml-1,说明该蛋白为琼胶酶。结论：采用分子克隆技术分离出新的琼胶酶基因,该基因的发现为活性寡糖的制备提供了新的工具。     

短小芽孢杆菌耐碱性β-甘露聚糖酶基因的异源表达及其酶学特性

摘要:【目的】本研究报道了一种新颖的耐碱性β-甘露聚糖酶基因的异源表达并研究其酶学特性,为其工业应用奠定基础。【方法】通过基因同源性分析以及染色体步移技术,从短小芽孢杆菌Nsic-2中克隆得到甘露聚糖酶基因(manB)。然后分别将manB基因在大肠杆菌BL21(DE3)和枯草芽胞杆菌WB800N中进行表达,并研究其酶学特性。【结果】克隆得到的manB基因序列有一个含1104 bp的开放阅读框,编码一种含有367个氨基酸的甘露聚糖酶(ManB)。经预测其蛋白序列N末端有一个含有31个氨基酸的信号肽。将ManB的氨基酸序列进行同源性分析,发现其与来源于短小芽孢杆菌CCAM080065的甘露聚糖酶具有很高的一致性,可以推测ManB属于糖苷水解酶家族26。manB基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达,得到甘露聚糖酶最高酶活为11021.3 U/mL。与其它甘露聚糖酶比较,ManB在碱性条件下表现出较高的稳定性,在pH6.0－9.0之间酶活相对稳定。纯化后的ManB比活可达4191±107 U/mg。酶反应动力学参数Km和Vmax分别为35.7 mg/mL和14.9 μmol/(mL·min)。同时,在枯草芽胞杆菌WB800N中也成功地实现了重组蛋白ManB的分泌表达。【结论】β-甘露聚糖酶基因成功实现异源表达,并得到其酶学性质。本文是首次报道从臭豆腐卤液中分离菌株,克隆表达甘露聚糖酶,并描述其酶学特性。ManB在碱性条件下的酶活稳定性,使得其在工业应用中具备较高的潜在应用价值。     

需钠弧菌WPAGA4菌株3条琼胶酶基因克隆、表达与酶学性质分析

【目的】本文拟从西太平洋深海沉积物中分离得到的需钠弧菌(Vibrio natriegens) WPAGA4菌株中克隆并表达3条β-琼胶酶基因agaW3418、agaW3419和agaW3472,并对其酶学性质进行研究。【方法】通过克隆表达技术将得到的3条琼胶酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行表达,通过二硝基水杨酸(DNS)法测定重组琼胶酶的酶活,并对其中活性最优的一种琼胶酶进行热稳定性和产酶条件优化。【结果】三种琼脂酶均为属于GH50家族。AgaW3418、AgaW3419和AgaW3472在温度分别为50、60和30℃以及pH值分别为6.0、7.0和7.0条件下,发挥作用的能力最强。其中琼胶酶AgaW3472表现出最优的酶活性质,在20℃下保持良好的稳定性,且在SOB (super optimal broth)培养基条件下以1%(质量体积分数)的乳糖作为碳源,同时添加20 mmol/L MgCl2,并将诱导温度和异丙基-1硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1 thio-β-D-galactoside, IPTG)浓度分别设置为37℃和0.1 mmol/L时能够获得...     

一株降解纤维素放线菌的产纤维素酶基因克隆与表达

【背景】纤维素在自然界中储量丰富,但天然纤维素的难降解性成为广泛应用纤维素资源的壁垒,近年来利用微生物来降解纤维素成为热点研究。【目的】筛选分离得到一株具有降解纤维素功能的放线菌菌株Lb1,通过全基因组测序确定其产纤维素酶关键基因5676,对基因5676进行克隆转化,使其在大肠杆菌中进行表达。【方法】通过基因工程技术将产纤维素基因连接到表达质粒上并导入表达菌株,对其降解纤维素生成葡萄糖的能力进行探究。【结果】将Lb1菌株的16S rRNA基因进行比对,确定菌株Lb1属于链霉菌属,命名为Streptomyces sp. Lb1。成功构建出纤维素酶表达载体,并且导入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株的产纤维素酶能力大于空载菌株。【结论】通过基因工程技术成功克隆出产纤维素酶基因,从而表达纤维素酶,为今后利用微生物降解纤维素的大规模应用提供参考。     

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达

摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。     

马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达

【目的】研究羰基还原酶基因的克隆、表达及其在不对称生物催化中的应用。【方法】对羰基还原酶氨基酸序列进行BLAST推导出核苷酸序列,设计引物,以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus)CGMCC 2.1977全基因组为模板,通过PCR扩增目的片段,与载体pET-28a连接,转化大肠杆菌获得重组菌BL21(DE3)-(pET28a-cMCR)和Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR)。【结果】扩增的序列与已报道的mer序列有100%同源性,全长1 038 bp,共编码345个氨基酸。目的蛋白在Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR)得到了高效表达,大小为42 kD。该酶最适反应温度为40°C,最适反应pH是8,热稳定性与pH稳定性较差。Ca2+对酶活具有明显的激活作用,且浓度为0.5 mmol/L时效果最好。重组菌可还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE],光学纯度为100%,转化率为81.0%。重组菌在制备度洛西汀关键中间体(S)-氮,氮-二甲基-3-羟基-(2-噻吩)-l-丙胺[(S)-DHTP]中也得到初步应用。【结论】从菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyce marxianus)CGMCC 2.1977中克隆获得了羰基还原酶基因,在大肠杆菌中成功表达,并可应用于不对称还原。     

硝磺草酮抗性菌株的筛选及抗性基因的克隆表达

【目的】从采集的土壤中筛选出硝磺草酮的抗性菌株,并从中克隆对羟苯基丙酮酸双加氧酶抗性基因。【方法】以酪氨酸为唯一碳源,采用富集培养法筛选分离硝磺草酮抗性菌株,利用16S rRNA基因序列分析对菌株进行初步鉴定。通过PCR扩增获得其HHPD基因序列,构建pETH4表达载体并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达。通过检测色素在440 nm处的吸收值分析菌株E. coli BL21(DE3)-pETH4对硝磺草酮的抗性特性。【结果】在含10 mmol/L硝磺草酮和1 g/L酪氨酸的选择培养基上,分离得到7株硝磺草酮抗性细菌,1株为不动杆菌属,2株为无色杆菌属,4株为假单胞菌属。从抗性最佳的Pseudomonas sp. AM-H4中扩增得到HPPD的基因片段为1 056 bp,其序列与Acinetobacter baumannii基因组中HPPD的基因序列相似性达到99%,341位点由天冬氨酸突变为丙氨酸。HPPD基因在大肠杆菌中实现异源表达,蛋白分子量大小约40 kD。菌株E. coli BL21(DE3)-pETH4在40 μmol/L硝磺草酮酪氨酸LB培养基中的色素吸收值显著降低,能够耐受高于200 μmol/L的硝磺草酮。【结论】克隆获得的HPPD具有良好的硝磺草酮抗性,将在新除草剂抗性作物选育中有一定的应用潜力。     

基因重组大肠杆菌表达血红素加氧酶-1及培养条件优化

【背景】血红素加氧酶-1 (HO-1)具有抗氧化应激、抗凋亡和抗纤维化等多种生理效应,有望成为一种新型药物应用于临床疾病的治疗。【目的】构建表达HO-1的基因重组大肠杆菌(Escherichiacoli),并优化其表达培养条件,实现HO-1高产率的表达。【方法】PCR法克隆集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的HO-1基因(ho1),构建重组质粒pET-28a-ho1,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,单因素实验优化表达培养基的种类、诱导剂添加时间、诱导培养时间、诱导剂浓度和诱导培养温度。【结果】构建了表达HO-1的基因重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-ho1菌株,用甘油(GY)培养基培养至菌体浓度OD_(600)约为0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导,30°C诱导培养6 h,HO-1的表达量最高,Ni-NTA柱分离纯化得到的HO-1收率占细胞总蛋白的10.9%。【结论】获得了可溶性表达HO-1的基因重组大肠杆菌及其较佳的培养条件,为进一步研究集胞藻来源的HO-1的酶学性质和应用奠定了基础。     

一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析

【目的】克隆耐冷菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)的几丁质酶基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其酶解产物。【方法】采用PCR扩增法从Pseudoalteromonas sp.DL-6中克隆几丁质酶基因(chi A),连接到表达载体p ET28a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测几丁质酶Chi A的分子量与纯度,4-甲基伞形酮荧光底物4MU-(Glc NAc)2测定酶活,电喷雾质谱(ESI-MS)检测酶解产物。【结果】chi A基因(Gen Bank登录号KF234015)在大肠杆菌中高效表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶Chi A的总活力可达168.68 U。ESI-MS检测结果表明重组蛋白酶解1%胶体几丁质的产物为几丁寡糖。【结论】利用内切几丁质酶Chi A水解几丁质生产几丁寡糖,为其在食品、医药和农业等领域的潜在应用提供有利参考。     

小菜蛾气味受体蛋白PlxyOr83b基因的克隆及表达

【目的】克隆小菜蛾Plutella xyostella气味受体Or83b基因, 并进行原核表达, 为研究小菜蛾寄主选择行为的分子机理, 开发昆虫行为调节剂提供基础。【方法】提取小菜蛾的总RNA, 反转录获得总cDNA, 采用RT-PCR方法扩增目的基因, 将其克隆至T载体并测序, 然后将目的基因克隆到大肠杆菌Escherichia coli表达载体pET-32a (+)中表达。经酶切、 PCR及测序鉴定正确后转化BL21 (DE3)菌株, 用IPTG诱导表达, 通过SDS-PAGE, Western印迹鉴定表达蛋白。【结果】获得了编码小菜蛾Or83b的cDNA序列, 该基因阅读框长1 413 bp, 编码471个氨基酸, 预测的等电点为7.19, 命名为PlxyOr83b（GenBank登录号为GQ923610）; 成功构建了pET-PlxyOr83b原核表达重组质粒, 目的基因获得高效表达, 其融合蛋白分子量为32.0 kD, Western blot 检测结果进一步表明PlxyOr83b在大肠杆菌DE3中得到正确表达。【结论】成功克隆和表达了小菜蛾气味受体基因PlxyOr83b, 该基因与其他昆虫Or83b基因基本一致。     

信号肽及化学通透剂对环糊精葡萄糖基转移酶胞外分泌的影响

【目的】研究不同的信号肽和化学通透剂对重组环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)胞外分泌的影响,提高CGTase的胞外分泌量。【方法】扩增地芽孢杆菌CHB1(Geobacillus sp.CHB1)的CGTase基因,构建带有地芽孢杆菌CHB1自身信号肽、Omp A、Pel B信号肽和不带信号肽的4种重组质粒;比较4种重组质粒对重组CGTase胞外分泌的影响,筛选最优的信号肽;考察甘氨酸、Triton X-100、SDS和Tween 80四种化学通透剂对重组CGTase胞外分泌的影响,确定最佳的化学通透剂及其浓度。【结果】Omp A信号肽介导的分泌效果最好,胞外酶活达到7.44 U/m L,分别是Pel B、CHB1信号肽的2.04倍和11.27倍,不带信号肽的重组质粒菌胞外检测不到酶活;携带Omp A信号肽的重组质粒菌发酵48 h,同时添加浓度为0.6%的甘氨酸和0.3%的Triton X-100,胞外酶活达最大到14.27 U/m L;SDS和Tween 80对该酶的胞外分泌具有明显的抑制作用。【结论】Omp A信号肽的介导效果最佳,同时添加浓度为0.6%和0.3%的甘氨酸和Triton X-100可以有效促进胞外分泌,为该重组酶的高效胞外分泌提供了一种有效的方法。     

对硝基苯酚降解菌Pseudomonas sp. PDS-7的降解特性及 其降解相关基因的克隆

[目的]本研究的目的是分离对硝基苯酚(PNP)降解菌,研究其对PNP的降解特性;克隆其降解相关基因,并进行表达.[方法]本研究通过富集培养法和系列稀释平板涂布法分离PNP降解菌株;采用形态观察、生理生化特征测定和16S rDNA分析对菌株进行初步鉴定;通过摇瓶试验研究菌株降解特性;利用SEFA-PCR技术克隆降解相关基因,并亚克隆到表达载体pET29a中,构建重组表达质粒pETpnpC,再转入受体菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达;通过分光光度法测定表达产物的酶活力.[结果]分离到一株PNP降解菌PDS-7,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp.);该菌株能够以PNP作为唯一碳源、氮源和能源生长,菌株对PNP的最高耐受浓度为80 mg/L,最适降解温度为30℃,偏碱性条件有利于菌株对PNP的降解;克隆了PNP降解过程中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC及马来酰醋酸还原酶基因pnpD(GenBank登陆号EU233791);将pnpC在E.coli BL21(DE3)菌株进行了诱导表达,表达产物对偏苯三酚和邻苯二酚均有邻位开环活性,比活力分别为0.45 U/mg protein和0.37 U/mg protein,表明偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC得到了活性表达.[结论]分离鉴定了一株PNP降解菌Pseudomonas sp.PDS-7,研究了该菌株的降解特性,克隆和表达了降解相关基因.     

麻类脱胶高效菌株果胶裂解酶基因克隆与表达

【目的】克隆麻类脱胶高效菌株Dickeya sp.DCE-01的果胶裂解酶基因并进行原核表达,对表达产物进行纯化和酶学性质研究。【方法】根据该菌株全基因组序列预测的果胶裂解酶基因Q59419设计引物,PCR扩增后将该基因连接到pEASY-E1和pACYCDuet-1载体上,导入E.coli BL21(DE3)进行表达。选择酶活力高的阳性克隆子进行大量诱导表达后,采用超滤和Sephadex G-100凝胶层析两步法纯化出果胶裂解酶,研究其酶学性质。【结果】克隆到果胶裂解酶基因pel(GenBank登录号:JX964997),其序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸。pACYCDuet-1-pel-BL表达胞外果胶裂解酶活力最高,发酵液粗酶活达298.8 IU/mL。其最适反应温度为50°C,最适pH为9.0;保温1 h,酶活稳定温度≤45°C,稳定pH为9.0?10.0。酶催化作用依赖于Ca2+,其最适作用浓度为2 mmol/L;Zn2+、Ca2+和NH4+促进酶活力,Fe3+和Pb2+严重抑制酶活力;聚半乳糖醛酸钠为该酶的最适底物。【结论】从麻类脱胶高效菌株中发掘到碱性果胶裂解酶基因,其表达产物在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景。     

诺卡氏菌酰胺酶基因的分子克隆及在大肠杆菌中表达的初步研究

酰胺酶是一种重要的工业酶。利用生物信息学手段,在和已知酰胺酶基因序列分析比对的基础上,首次从Ncordiasp.YS-2002中成功地克隆得到酰胺酶基因ami,并对其基因序列及氨基酸序列的性质进行了分析。结果表明,所得酰胺酶基因ami片段大小共为1446bp,由启动子区、阅读框和回文结构终止区三部分构成。序列分析和进化树分析表明,Ncordiasp.YS-2002酰胺酶是一种比较特殊的酰胺酶,不含大多数酰胺酶共同具有的保守区序列。进一步将酰胺酶基因连接到pET-28a( )上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中筛选获得重组菌株PEAB。酶活测定结果表明重组菌具有酰胺酶酶活,但较低,其原因可能是因为大量表达的产物主要以包涵体的形式存在。     

Cloning,expression, and characterization of an alkaline protease,AprV, from Vibrio sp. DA1-1

Bioprocess and Biosystems Engineering - A novel alkaline protease (named AprV) gene from Vibrio sp. DA1-1 was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. The sequence analysis showed...     

Expression of the Na+/H+ antiporter gene (g1-nhaC) of alkaliphilic Bacillus sp. G1 in Escherichia coli

A Na(+)/H(+) antiporter gene was isolated from alkaliphilic Bacillus sp. G1. The full-length sequence of the Na(+)/H(+) antiporter gene was obtained using a genome walking method, and designated as g1-nhaC. An ORF preceded by a promoter-like sequence and a Shine-Dalgarno sequence, and followed by a terminator-like sequence was identified. The deduced amino acid sequence consists of 535 amino acids, and a calculated molecular mass of 57 776 Da. g1-nhaC was subsequently cloned into pET22b(+) and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Recombinant E. coli harboring the g1-nhaC gene was able to grow in modified L medium at various concentrations of NaCl (0.2-2.0 M) at different pH values. The recombinant bacteria grew well in the medium with concentrations of NaCl as high as 1.75 M at pH 8.0-9.0. Minimal growth was observed at 2.0 M NaCl, pH 8.0-9.0. At pH 10, the recombinant bacteria grew well in a medium with a low concentration of NaCl (0.2 M). These results suggested that the g1-NhaC antiporter from Bacillus sp. G1 plays a role in Na(+) extrusion at lower pH values and in pH homeostasis at pH 10 under Na(+)-limiting conditions.     

苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达

[目的]本研究的目的是分析从四川生态条件下分离的苏云金芽胞杆菌Rpp39菌株的特性,从分子水平上揭示该菌株对鳞翅目高毒力的原因;进一步从中分离克隆cry2Aa基因,并对其进行初步的表达研究.[方法]本研究主要采用扫描电镜观察、PCR-RFLP鉴定法和SDS-PAGE分析法研究菌株的特性;采用PCR直接克隆法克隆cry2Aa全长基因,并亚克隆到原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-2Aa,再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达;采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾和水稻二化螟的毒力.[结果]经扫描电镜观察菌株Rpp39主要产生菱形、方形和圆形3种伴胞晶体;SDS-PAGE分析表明主要产生130 kDa和60 kDa左右2种蛋白;经PCR-RFLP鉴定,该菌株含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ia和cry2Aa五类杀虫晶体蛋白基因;1种cry2Aa类杀虫晶体蛋白全长基因被克隆,序列分析显示该基因的开放阅读框(ORF)为1902 bps,编码由634个氨基酸组成的蛋白质,氨基酸序列与Cry2Aa1蛋白同源性为99.7%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Aa12.重组表达质粒pET-2Aa在E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE电泳验证含有65 kDa表达蛋白.生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对小菜蛾和二化螟具有杀虫活性,LC50分别为5.4 μg/mL和22.3μg/mL.[结论]菌株Rpp39及从中分离克隆的cry2Aa12基因来自四川生态条件,丰富了菌株及基因的资源,在资源积累方面具有重要意义.     

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。