基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化

目的:构建基于Xcm I识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化。方法:首先将5’和3’端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 c DNA定向克隆至p CDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于p CDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理,分别将长度为312 bp和1 329 bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率。结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的 DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理也能够显著增加连接效率。结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索。     

荧光标记复合PCR扩增微卫星位点的构建与优化

本研究采用毛细管电泳技术,构建并优化了荧光标记复合PCR同时扩增多个微卫星位点。主要过程为：首先根据设计所扩增微卫星位点的期望长度,将9个微卫星位点分成两组,5个位点用FAM（蓝色）标记,4个位点用HEX（绿色）标记;两种荧光类型分组优化,用琼脂糖胶电泳检测。其次,荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点,采用ABI3730xl毛细管电泳检测,以ROX500（红色）为长度标准物,结果经Genemapper3.5软件 分析,检测结果表明毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物不仅精确读取微卫星位点的长度（分辨率高达1bp）,还能区分微卫星位点复制时滑链所引起的“回声斑”;调整各微卫星位点引物比列使所有位点扩增强弱均匀。最后,逐一检测复合PCR基本参数（dNTP浓度、 PCR程序和模版DNA用量）对复合PCR产物的影响,优化PCR。结果表明通过毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物来读取微卫星位点的基因型具有精确性、高效性和稳定性。     

高产王浆西蜂DNA分子中的相关基因标志筛选及其鉴定

为了探讨西蜂与高产王浆相关特异基因标记 ,用 12种随机引物 (P1～P12 )对产王浆量不同的4品系西蜂的基因组DNA进行了RAPD PCR分析 ,分别获得了产王浆量高、低不同西蜂的DNA多态性图谱 ,并从P2 引物的DNA多态性图谱中筛选出一差异DNA片段P2 316bp .将P2 316bp差异DNA片段用地高辛标记制备成探针 ,进行Southern杂交鉴定 .实验显示 ,探针与高产王浆西蜂基因组DNA的扩增产物出现了阳性杂交信号 ,而与低产王浆西蜂基因组DNA的扩增产物未出现阳性杂交信号 .结果表明 ,该差异性基因片段P2 316bp是西蜂高产王浆优良性状相关的遗传标记 ,序列为 30 5个核苷酸 .     

DNA足纹步移作图法

一种以PCR介导的、可对任意长度靶DNA片段上的核蛋白结合位点进行DNA足纹作图分析的新方法.原理是：采用被随机降解靶DNA分子作为模板,用标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物进行单链扩增.首先,利用某种化学试剂或酶如DNaseⅠ对已与蛋白质结合或未结合的双链靶DNA进行随机降解,在一定条件下使每一个DNA分子恰好只有一个位点被切割.然后,这些被随机降解DNA分子即可作为模板,用同位素标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物（正向或反向）进行单链扩增.最后,扩增的单链产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影形成DNA片段梯队,而被蛋白质保护的位点则在DNA片段梯队中形成位置缺口,从而确定DNA与蛋白质相结合的精确位点.该方法被应用对人干细胞因子基因5′旁侧－1190～－273区域的DNA足纹部分作图.     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

一种简便、快捷的胰蛋白酶抑制剂基因的分离与克隆方法

从 3个豇豆品种幼嫩叶片中分离出核基因组 DNA,参照已知的几种 Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂基因序列 ,设计合成了 2 7bp,且含有 Bam H I位点的寡核苷酸引物 ,分别以 3种豇豆核基因组 DNA为模板 ,PCR扩增 ,均得到长度约为 3 40 bp的 DNA片段。产物 DNA片段经 DNA序列分析 ,结果表明三者的碱基序列相同 ,与报道的胰蛋白酶抑制剂基因相比 ,同源性为 1 0 0 %和 99.7%。     

短尾猴样品常见污染的检测方法

为检测在野外通过非损伤取样法采集到的短尾猴样品是否受到其它常见哺乳动物及人源的污染,收集包括短尾猴(Macaca thibetana)、人以及7种常见哺乳动物的毛发、血液、粪便、精液或肌肉组织样品,提取并纯化基因组DNA,利用14对微卫星引物扩增不同物种的STR位点,以确定其在短尾猴样品检测中的应用价值。扩增结果表明,TH01等13对引物在人和短尾猴中均能扩增且扩增产物长度未见明显差异,F13A01产物长度在人和短尾猴之间相差240bp碱基,只有FGA位点在常见动物猪、羊、牛、狗、兔、小白鼠及豚鼠都未见扩增产物;因此,FGA、F13A01座位较高的分辨能力,可以排除短尾猴样品是否受到人及常见哺乳动物的污染,通过特异性STR引物结合PCR方法,检测短尾猴野外非损伤取样获得的样品是否受到哺乳动物及人源DNA污染,此方法简单、稳定性高、可重复性好,在短尾猴的遗传多样性分析及亲缘关系鉴定中有较大的应价值。     

SRAP技术在遗传的研究进展

SRAP是一种新型的DNA分子标记,具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点。SRAP利用独特的引物设计对开放读码框(ORFs)进行扩增,上游引物长17bp,对外显子进行特异扩增,下游引物长18bp,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增,因个体不同及其物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。本文阐述SRAP的原理和操作流程,综述了SRAP标记目前在植物遗传图谱构建、遗传多样性、基因定位、基因克隆、杂种优势利用等方面的研究进展及应用前景。     

BALB/c小鼠遗传质量检测的新方法

目的比较随即扩增多态性方法（RAPD）、微卫星方法（STR）与生化标记方法对近交系小鼠遗传质量检测的差异,为近交系动物遗传质量控制提供一种分子生物学方法。方法提取近交系小鼠BALB/c基因组DNA,用6条RAPD引物和20对STR引物对其进行PCR扩增,用生化标记法检测13个位点。结果在6条RAPD引物中,引物2（p2）、引物3（p3）、引物5（p5）和引物6（p6）这四条引物扩增的条带出现差异,表现为不同的RAPD图谱;在20对STR引物中,引物2、4、10和11,这四对引物扩增的条带出现差异,表现为不同的STR图谱;13个生化标记位点中,过氧化氢酶-2（Ce-2）等6个生化位点发现杂合基因。结论RAPD和STR可用于验证生化标记方法的实验结果,并用于保证近交系动物的遗传质量。     

大白菜高通量SSR标记鉴定体系的建立和应用

大白菜是重要的蔬菜作物,准确鉴定大白菜品种对于大白菜种质资源管理、新品种测试、种子质量检测等具有重要意义。本研究从已定位到大白菜10个连锁群的205个SSR标记中,筛选出30个在连锁群上分布均匀、PCR扩增稳定、带型简单的标记,用于大白菜品种DNA指纹鉴定。对入选的引物用4种荧光染料进行了标记,利用基于毛细管电泳荧光检测的DNA分析仪对SSR扩增产物进行检测。通过比较分析2种不同型号的3台DNA分析仪的扩增片段检测数据,明确了不同DNA分析仪的检测数据间一般存在明显的系统误差。系统误差的大小取决于引物,一般在1~4 bp之间。使用扩增产物的片段长度对各SSR位点的不同等位变异进行命名。通过使用一组参照品种,消除了不同批次、不同DNA分析仪型号间的系统误差,保证了检测数据的可重复性和可再现性。在此基础上,对184份大白菜品种进行了DNA分子数据采集。