铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与原核表达

应用同源序列克隆法克隆了铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因cDNA全长,并进行了原核表达分析,为进一步研究该基因的时空表达、功能分析及多糖合成机理提供理论依据。结果表明:(1)铁皮石斛SPS基因cDNA全长3 502bp,编码区3 186bp,GenBank登录号JF423929。该基因编码1 061个氨基酸,与文心兰的SPS基因氨基酸序列的一致性最高为93%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于60%。(2)原核诱导表达结果显示,SPS基因在大肠杆菌中的重组蛋白分子质量约为118.7kD,其表达与序列分析推测的结论一致。(3)生物信息学分析表明,铁皮石斛SPS基因的二级结构包括了螺旋、β-折叠和无规则卷曲,是非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。     

一个新的忽地笑O-甲基转移酶基因的克隆与原核表达

采用RACE技术克隆得到一个新的忽地笑O-甲基转移酶（OMT）基因,命名为LaOMT。LaOMT的cDNA序列为1379 bp,开放阅读框1077 bp,预测编码蛋白包含358个氨基酸。序列比对分析发现, LaOMT编码的蛋白序列具有依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的高度保守的结构域,与葡萄、大豆等其他植物OMTs蛋白的相似性为50%左右。将LaOMT基因连接到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌Rosetta （DE3）的SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白受异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,分子量大小约为45 kDa,与已报导的其他植物的OMTs蛋白大小基本一致。此外,半定量RT-PCR分析结果表明, LaOMT在忽地笑的叶、鳞茎、根和花中均有表达,其中花中的表达量最低。     

草莓ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ζ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸。序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近。原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达。用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花红果粉红果白果青果叶。     

草莓ξ-胡萝卜素脱氢酶基因ZDS的克隆及特征分析

用RT-PCR和RACE技术从草莓(Fragaria ananassa Duchesne)果实中克隆到ξ-胡萝卜素脱氧酶基因ZDS,命名为FaZDS,其cDNA全长2148 bp,具有1个1710 bp的完整开放阅读框(ORF),编码569个氨基酸.序列分析表明,FaZDS编码的氨基酸序列与其它植物的ZDS蛋白有很高的相似性.系统进化树分析表明,草莓与苹果的ZDS蛋白亲缘关系较近.原核表达结果表明FaZDS基因在大肠杆菌中能高效表达.用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析表明,FaZDS基因在草每的花、叶片和果实中均有表达,表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞叶.     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的：对DEV贵州分离株NP基因进行克隆与序列分析,构建NP基因的原核表达载体,分析NP基因原核表达产物的免疫反应性。方法：根据GeneBank登载的DENNP基因序列设计引物,对DEV贵州分离株进行PCR扩增、克隆和测序,采用生物信息学软件程序分析NP蛋白的氨基酸序列;将该基因插入到原核表达载体pET32a上进行原核表达和Western Blotting分析。结果：DEV贵州分离株NP基因全长759bp,核苷酸序列与参考株一致;NP基因编码蛋白相对分子量为27．1kDa,理论pI为5．89,肽链上第10．15、88．92和182．186区段及其附近区域可能是B细胞表位优势区;构建得到的重组质粒pET32-NP可表达出一条大小约为48kDa的蛋白,且能与兔抗DEN-IgG发生特异性结合。结论：NP基因在DEN基因组中高度保守,其原核表达产物具有良好的免疫反应性。     

川芎咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析

克隆川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因并做序列分析。采用RT-PCR方法,以新鲜的川芎嫩叶c DNA为模板,克隆出川芎COMT基因的c DNA序列。此基因全长1328 bp,编码360个氨基酸。将得到的序列提交Gen Bank,序列号为KU942388。此川芎COMT具有植物O-甲基转移酶家族特征性的功能结构域,与中粒咖啡、牵牛花COMT的氨基酸序列同源性分别为70%、69%,推测其能够催化咖啡酸的氧甲基化反应。该川芎COMT基因的成功克隆为下一步活性验证及利用生物技术来生产阿魏酸奠定坚实基础。     

川西獐牙菜SmDL7H基因原核表达及组织表达

该研究根据川西獐牙菜转录组信息获得7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的全长cDNA序列,对该基因进行同源克隆、生物信息学分析,并构建原核表达载体、转化大肠杆菌、进行原核表达和组织特异性表达分析,以探讨川西獐牙菜裂环烯醚萜合成途径中关键酶7-脱氧马钱子酸羟化酶(SmDL7H)基因的功能,为研究裂环烯醚萜类化合物合成途径奠定基础。结果表明:(1)成功克隆了川西獐牙菜SmDL7 H基因(GenBank登录号为MH243070);SmDL7 H基因开放阅读框为1 554bp,编码517个氨基酸,相对分子质量为59.5kD,等电点9.02;生物信息学预测SmDL7 H基因编码蛋白无信号肽。(2)多序列比对及进化树分析显示,SmDL7 H编码的蛋白与滇龙胆、长春花、金银花等植物的DL7 H基因编码的蛋白具有较高相似性。(3)将SmDL7 H基因连接到pET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用0.1mol/L IPTG于25℃诱导12h,原核表达分析发现在59.5kD处有目的蛋白出现,表明与之前预测的蛋白大小一致。(4)荧光定量PCR分析显示,SmDL7 H基因在川西獐牙菜叶、茎、花、根、愈伤组织中均有表达,其中在叶片中表达量最高,在根中表达量最低。     

板栗咖啡酸氧甲基转移酶基因CmCOMT的克隆及原核表达

该研究根据板栗(Castanea mollissima Bl.)cDNA文库分析得到EST序列,采用RT-PCR技术,克隆板栗咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)基因全长cDNA(CmCOMT),分析其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究,为板栗木质素合成关键酶基因CmCOMT的生物学功能研究与应用奠定基础。结果表明:(1)CmCOMT基因(GenBank登录号为KU365322)具有一个1 098bp开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,推测蛋白分子质量为39.684 9kD,理论等电点为5.83,具有植物SAM依赖甲基转移酶的典型特征。(2)CmCOMT核苷酸序列及其编码氨基酸序列与垂枝桦(Betula pendula)和白桦(Betula platyphylla)的相应序列一致性均在90%以上;同源建模表明,CmCOMT的3D模型与苜蓿(Medicago sativa)MsCOMT的蛋白结构相似,推测其可能与MsCOMT具有相似的功能;系统发育树分析显示,CmCOMT与其他植物COMTs具有相同的进化祖先,与桦木科植物物种亲缘关系最近。(3)SDS-PAGE电泳分析表明,CmCOMT蛋白最佳诱导表达条件为0.3mmol/L IPTG在25℃下诱导6h,蛋白分子量约为44kD,其主要以可溶性蛋白的形式存在。     

水母雪莲通气组织形成的相关基因SmLSD1克隆及表达

该研究以水母雪莲为实验材料,通过RT-PCR结合RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmLSD1(GenBank登录号为OL690334),并对该基因在不同胁迫下的表达量及编码蛋白结构进行测定分析。结果表明：(1)水母雪莲SmLSD1基因全长965 bp,包含537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。(2)同源序列比对发现,水母雪莲SmLSD1蛋白与菊科植物牛蒡LSD1的氨基酸序列相似性最高,达到98.31%。(3)亚细胞定位显示SmLSD1基因主要在细胞核和细胞膜上表达;原核表达显示,SmLSD1基因编码氨基酸的分子量约为18 kD。(4)荧光定量分析显示,SmLSD1基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;在低温、低氧及紫外胁迫下,SmLSD1基因的表达量下调。研究推测,SmLSD1基因在水母雪莲通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。     

小地老虎UV视蛋白基因的克隆及序列分析

视蛋白是感光物质的重要组成成分,是动物感知周围光环境的重要途径之一。本文以小地老虎(Agrotis ypsilon)3日龄成虫为材料,利用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆得到小地老虎UV视蛋白基因的cDNA序列。序列分析表明,小地老虎视蛋白基因的cDNA序列1 632 bp,包括一个1 140 bp的完整开放阅读框架,编码379个氨基酸,理论蛋白分子量(Mw)41.50 ku,等电点(pI)7.56。GenBank登录号为JN185654。UV视蛋白包括7个跨膜拓扑结构和一个G蛋白偶联受体家族,第107位赖氨酸与UV视蛋白的紫外敏感性有重要关系。同源性分析显示,小地老虎UV视蛋白基因与其他昆虫的UV视蛋白基因具有较高同源性。本研究对深入探究UV视蛋白在动物夜行生活中的作用具有重要意义。     

甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术从甜荞中克隆得到查耳酮合酶(CHS)的cDNA开放阅读框(ORF)序列,命名为FeChs,NCBI登录号为GU172166.1.该序列长1 179 bp,编码392个氨基酸,与其它植物CHS基因的同源性为78%～92%,其推导的氨基酸序列含有CHS高度保守的活性位点及CHS的标签序列GFGPG.     

宁夏枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的cDNA克隆及其表达分析

为探讨宁夏枸杞(Lycium barbarum)苯丙氨酸解氨酶基因(LbPAL)的表达特征,采用PCR法克隆了宁夏枸杞LbPAL基因的cDNA,并用实时定量PCR法分析了其表达特征。结果表明:宁夏枸杞的LbPAL基因的全长cDNA为2321 bp,包含2163 bp、编码720个氨基酸的开放阅读框;LbPAL与茄科其他物种的PAL氨基酸序列及三维结构具有较高保守性;与茄科物种的PAL聚类在同一个分支中。LbPAL在叶、花瓣、S1期果实的表达量较高,而在根及S2~S5期果实的表达水平较低。在NaCl胁迫处理下,LbPAL在根和茎中的表达量均有下调的趋势;而在叶片中,LbPAL表达量先急剧增加而后急剧下降并趋于稳定。这为解析宁夏枸杞中类黄酮化合物的生物合成调节及生理功能提供了参考。     

脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因的克隆及表达分析

应用RACE技术克隆脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因, 并通过攻毒实验揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因的先天免疫防御作用, 为脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的免疫防治研究提供依据和思路。研究成功克隆了脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因全长cDNA序列, 该大亚基cDNA全长 2192 bp, 开放式阅读框长 2034 bp, 5′非编码区长 21 bp, 3′非编码区长 137 bp, 将该基因命名为 EcHcL。EcHcL编码 667 个氨基酸, 前 21 个氨基酸组成信号肽, 推测成熟肽的分子量为 78.5 kD。Blast比对结果显示, 由脊尾白虾血蓝蛋白EcHcL序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别达到 87%、73%, 其M结构域氨基酸序列与斑节对虾、日本对虾等物种同源性性高达 90% 左右, 由此推断该cDNA序列属于血蓝蛋白家族。组织表达分析结果显示, EcHcL基因在脊尾白虾鳃、卵巢、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、胃、腹神经节、眼柄、血细胞中均有表达, 肝胰腺中相对表达量最高。Real-time PCR分析发现EcHcL基因在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后脊尾白虾肝胰腺和血细胞中的表达量显著增加, 并具有不同的时空表达模式, 推测脊尾白虾EcHcL基因在免疫防御中具有重要作用。     

巴西橡胶树HbHEV3基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,通过RT-PCR获得了一个编码橡胶素前体的基因,命名为HbHEV3。HbHEV3编码区cDNA长度为630bp,编码209个氨基酸。预测的HbHEV3蛋白包含1个信号肽,1个具有几丁质结合特性的Hevein结构域和1个Barwinn结构域,HbHEV3与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性。分离获得了HbHEV3起始密码子上游1 050bp的启动子序列,该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量PCR分析结果表明,HbHEV3在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高,乙烯诱导能显著上调胶乳中HbHEV3的表达。研究表明,HbHEV3可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应,并在橡胶凝集过程中具有重要功能。     

独一味苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

以独一味叶片为材料,采用RT-PCR和RACE方法克隆了独一味苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的全长cDNA,命名为LrPAL基因。测序结果表明,LrPA L基因全长2 298 bp,含有1个2 145 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码714个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树分析表明,独一味LrPAL与唇形科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。用 Real-Time PCR方法检测发现,LrPAL基因在独一味的叶中表达量最高,茎中表达量最少。研究结果推测,从独一味中克隆获得的苯丙氨酸解氨酶基因（LrPAL）是典型的PAL家族成员,在独一味各组织发育过程中具有重要功能。     

Cloning of cDNA encoding COMT from wheat which is differentially expressed in lodging-sensitive and -resistant cultivars

In the present study two cDNA fragments were cloned by nested-PCR using degenerate primers for COMT and found to be 93% identical at the nucleotide level. The deduced amino acid sequence of the two cDNAs showed a high degree of identity with COMT from other plants and were most similar to COMTs from monocots. RNA gel blot hybridization demonstrated that the wheat COMT gene W-cm5-1 was expressed in stem, root and leaf tissues. W-cm5-1 mRNA levels in the developing wheat stem were associated with the stem lodging character in two wheat cultivars. These results suggest that the action of the wheat COMT gene may be related to stem rigidity and lodging character in wheat.     

雨生红球藻八氢番茄红素合成酶基因的克隆及表征

雨生红球藻是一种单细胞绿藻,在多种逆境胁迫条件下能够大量合成并迅速积累虾青素,其积累量最高可达细胞干重的4%,从而成为目前最理想的天然虾青素合成工具.八氢番茄红素合成酶(PSY)是虾青素合成途径中第一个限速酶.分离了八氢番茄红素合成酶基因(psy)的全长cDNA及基因组DNA.其全长cDNA包括1200个碱基,编码400个氨基酸,基因组DNA包括5个外显子,4个内含子.系统发育分析结果显示,绿藻的八氢番茄红素合成酶基因形成一个进化枝,它们与高等植物的psy亲缘关系比较近.通过GenomeWalking的方法,分离了psy基因约1kb的5′侧翼序列.将含有TATA-box和CAAT-box的297bp的序列与LacZ报告基因构成嵌合的表达载体,用基因枪法转化雨生红球藻.lacZ的瞬间表达检测结果表明,这段上游序列能够驱动lacZ表达,具有启动子活性.     

中国野生毛葡萄芪合成酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因,命名为VqDSTS1,并进行序列及表达模式分析.结果表明:VqDSTS1基因cDNA编码区全长为1 179bp,GenBank登录号为JQ342086,编码392个氨基酸;氨基酸序列分析表明,VqDSTS1含有芪合成酶基因家簇的特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’和‘GVLFGFG-PGLT’;序列比对显示,VqDSTS1与其他葡萄种质的芪合成酶氨基酸序列一致性在95.2%～98.7%之间;半定量RT-PCR分析表明,VqDSTS1受白粉病诱导表达,呈双峰模式.为进一步研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的表达及功能分析提供了基础.