AalDV-3介导的miRNA海绵载体构建及其在埃及伊蚊体内外的抑制效果测试

miRNA不仅广泛参与了蚊生长、发育的调控,还参与了媒介与病原体的相互作用,因此miRNAs可能作为蚊虫防制与蚊媒病原体控制的靶点,但目前尚无有效的转导系统。为研究白纹伊蚊浓核病毒-3(AalDV-3)是否可以作为有效的载体,我们利用内含子内表达miRNA海绵的策略,以埃及伊蚊内源性miR-210为靶基因,构建了重组病毒AalDV-anti-210。使用跨内含子引物通过RT-PCR验证了内含子可在蚊体内外的剪接效果,通过qPCR方法对埃及伊蚊Aag2细胞与埃及伊蚊幼虫的感染后的miR-210的表达水平进行检测。结果证实,含有miRNA海绵的内含子可以有效的蚊体内外剪接,重组病毒可以在蚊体内外高效的抑制靶miR-210的表达水平。该结果为探索AalDV-3在蚊虫基因功能研究及生物杀虫剂方面的潜在价值提供了理论依据。     

杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒 （SpltMNPV）的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBank SpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列（含启动子）和3′端侧翼序列（含终止子）,将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SpltMNPV 基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV-gfp。SpltMNPV-gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。     

犬α干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性的测定

犬α干扰素(Ca IFNα)在犬病防治过程中应用广泛。旨在开发一种高效的Ca IFNα表达方法。首先按家蚕密码子的偏好性对Gen Bank中的一个Ca IFNα基因进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体p VL1393中,并与亲本病毒Bm Bacmid共转染家蚕细胞进行细胞内重组。得到的重组病毒用于感染家蚕幼虫,收集发病幼虫的蚕血淋巴用于Ca IFNα检测。采用细胞病变抑制法在MDCK-VSV*GFP系统中测定其抗病毒活性。结果显示家蚕表达的Ca IFNα能有效抑制VSV*GFP在细胞内的复制,其抗病毒活性不低于1.78×106U/m L。     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒I型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T-easy载体.将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP.用脂质体将其与CVI988 株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况.表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒.     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒Ⅰ型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T—easy载体。将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒。     

猪γ干扰素在家蚕中的表达和抗病毒活性检测

干扰素在畜牧养殖业中可以用于病毒性传染病的治疗和疫苗免疫效力的提高,用杆状病毒表达系统在家蚕中表达了猪γ干扰素。根据已发表的序列对猪γ干扰素基因的密码子进行优化并合成,将其克隆到杆状病毒转移载体p VL1393上,与Bm Bacmid病毒基因组DNA共转染Bm N细胞系,获得重组病毒,猪γ干扰素基因位于重组Bm NPV病毒的多角体基因启动子下游。用该重组病毒感染家蚕获得含有猪γ干扰素的表达产物。Western blotting检测到表达产物中的猪γ干扰素,用微量细胞病变法利用干扰素抑制VSV-GFP感染VERO细胞的方法来测定干扰素活性,结果显示干扰素效价可以达到6×105 IU/m L以上。在家蚕幼虫体内成功表达并获得了有活性的猪γ干扰素。     

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒 (humanfoamyvirus ,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上 ,缺失病毒基因组的env基因和bel基因 ,构建了一个表达标记基因neo和报道基因 gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI GFP。在与辅助质粒 p△GP共转染情况下 ,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI GFP。该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞 ,将携带的外源基因整合于细胞染色体DNA上并实现表达     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

蚊虫

主要介绍蚊虫的特征及形态、生活史、生态习性、幼虫的孳生习性、对人类的危害及防治方法。     

Nuclear Receptors in Mosquito Vitellogenesis

Vitellogenesis in insects involves the coordinated activityof the fat body, which produces large amounts of yolk proteinprecursors (YP), and oocytes, which specifically accumulatethese proteins. The expression of YP genes is achieved throughstrict sex-, tissue-, and hormone-specific control in the femalefat body. In mosquitoes, expression of YP genes is controlledby 20-hydroxyecdysone (20E). To elucidate the role of 20E inmosquito vitellogenesis, we cloned cDNAs encoding the Aedesaegypti ecdysteroid receptor (AaEcR) and two isoforms of itsheterodimeric partner, the Ultraspiracle homologue (AaUSP).The two AaUSP isoforms differ in their A/B domains and havedistinct expression patterns. The ecdysone regulation of YPgenes likely involves products of early genes. We cloned thegene of the mosquito homologue to the Drosophila early geneE75 (AaE75) belonging to the nuclear receptor superfamily. Kineticsof AaE75 expression correlate with the expression of YP genes,suggesting that AaE75 may have a regulatory role in YP geneexpression. A second nuclear receptor superfamily member, theNGFI-B homologue AaHR38 is implicated in repression of the ecdysone-signalingpathway in the fat body of the previtellogenic female mosquitoat the state-of-arrest. Finally, three isoforms of the hepatocytenuclear factor 4 (HNF-4) homologue AaHNF-4 are differentiallyexpressed in the mosquito fat body during vitellogenesis, suggestingtheir involvement in regulating vitellogenic events in thistissue.     

Mosquito repellents in frog skin

The search for novel insect repellents has been driven by health concerns over established synthetic compounds such as diethyl-m-toluamide (DEET). Given the diversity of compounds known from frog skin and records of mosquito bite and ectoparasite infestation, the presence of mosquito repellents in frogs seemed plausible. We investigated frog skin secretions to confirm the existence of mosquito repellent properties. Litoria caerulea secretions were assessed for mosquito repellency by topical application on mice. The secretions provided protection against host-seeking Culex annulirostris mosquitoes. Olfactometer tests using aqueous washes of skin secretions from L. caerulea and four other frog species were conducted to determine whether volatile components were responsible for repellency. Volatiles from Litoria rubella and Uperoleia mjobergi secretions were repellent to C. annulirostris, albeit not as repellent as a DEET control. The demonstration of endogenous insect repellents in amphibians is novel, and demonstrates that many aspects of frog chemical ecology remain unexplored.     

Mosquito transposable elements

The completion of the genome assembly for the African malaria mosquito, Anopheles gambiae, and continuing genomic efforts for the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, have allowed the use of bioinformatics tools to identify and characterize a diverse array of transposable elements (TEs) in these and other mosquito genomes. An overview of the types and number of both RNA-mediated and DNA-mediated TEs that are found in mosquito genomes is presented. A number of novel and interesting TEs from these species are discussed in more detail. These findings have significant implications for our understanding of mosquito genome evolution and for future modifications of natural mosquito populations through the use of TE-mediated genetic transformation.     

灭蚊幼植物资源研究进展

植物源灭蚊幼剂由于其选择性强、安全、易降解等优点,逐渐得到了人们的青睐。近年来大致有两方面的研究,一是可以应用于灭蚊幼的植物种类,有菊种唇形科、芸香科、伞形科、豆科以及楝科等共50多科的150多种植物被研究报道,二是对植物中的有效成分的研究,发现其中起作用的成分大多属于萜类化合物和生物碱类化合物。我国在该领域的研究较薄弱,应加强灭蚊幼植物资源特别是有效成分和作用机理的研究。