巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高密度发酵研究进展

高密度发酵已经成为提高毕赤酵母目的蛋白表达量的关键技术之一,而其中发酵工艺又是高密度发酵的一个重要因素。主要从巴斯德毕赤酵母遗传学特性、表达宿主菌、表达载体、外源蛋白的表达方面进行了阐述,并从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计、发酵过程关键参数调控以及甲醇诱导等方面阐述毕赤酵母的高密度发酵。最后,提出了巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中存在的问题并进行展望。     

合成耐高温α-淀粉酶PFA在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220U／L。     

表达乙肝病毒包膜中蛋白的嗜甲醇毕赤酵母菌株的构建

巴斯德毕赤酵母是一种很有潜力的真核表达体系。本文报告将已克隆的乙型肝炎病毒ｐｒｅＳ２－Ｓ基因亚克隆于巴斯德毕赤酵母胞内表达质粒ｐＰＩＣ３,构建重组ｐＰＩＣ３／ｐｒｅＳ２－Ｓ质粒,经酶切线性化后,将其用电转化导入酵母细胞内,经ＰＣＲ及ｄｏｔｂｌｏｔ检测,挑选出在染色体上稳定整合了乙肝病毒包膜中蛋白编码基因的嗜甲醇毕赤酵母菌株,为高效表达乙肝病毒包膜中蛋白奠定了基础     

影响外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的外源蛋白表达系统.但外源基因在该系统中表达时,由于受自身特性及环境等诸多因素的影响,在表达过程中出现表达量不够稳定或较低,甚至不表达的情况.本文对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,并就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了简要的综述.     

巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望

巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一,成功地表达了许多重组异源蛋白。从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如：营养要求低、可高密度发酵、遗传稳定性高等;分析了可能影响巴斯德毕赤酵母表达系统的相关因素,这些因素包括外源基因的特性、基因拷贝数、产物稳定性及发酵策略等,结合这些因素和具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量进行了阐述;讨论了该表达系统存在的不足之处并且展望了其发展前景。     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

GAPDH基因克隆及其作为毕赤酵母内标物的可靠性研究

为了测定GAPDH在巴斯德毕赤酵母中作为内参蛋白的有效性,利用PCR鉴定巴斯德毕赤酵母中GAPDH基因,分别在含葡萄糖、甲醇、甘油培养基及不同温度下培养巴斯德毕赤酵母,采用SDS-PAGE、Western blotting和催化活性检测。测序结果与已报道的巴斯德毕赤酵母GAPDH基因完全一致。SDS-PAGE结果显示,表达蛋白分子量为35.4 kD,与预期分子量相符。Western blotting和催化活性测定显示,在葡萄糖诱导下GAPDH表达最高,甲醇次之,甘油最低。37℃下GAPDH表达略高于28℃。在同一诱导物或温度下,GAPDH表达不会随浓度或培养时间发生明显变化。结果表明,在同一种诱导方式下,GAPDH可以作为异源蛋白表达的内参对照。     

外源基因在巴斯德毕赤酵母中多拷贝整合的研究进展

巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)以其独特的生物学和遗传学特征已成功地表达了各种类型的外源蛋白。本文综述了巴斯德毕赤酵母的一些特征和优势,及其产生外源基因多拷贝的原理。了解如何通过多拷贝整合外源基因在巴斯德毕赤酵母中提高外源蛋白表达量、基因拷贝数与表达量的关系,以及如何定量和半定量鉴定拷贝数等,在理论研究和实践应用中,特别是在生物制药工业中具有重要意义.     

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因（cGH）的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH的毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。     

巴斯德毕赤酵母研究进展

巴斯德毕赤酵母以其独特的生物学和遗传特征成为当今一种诱人的外源基因表达系统,已成功地表达了各种类型的外源蛋白。本文综述了巴斯德毕赤酵母的一些特征及其作为外源基因表达系统,实现高表达的策略。     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统现在已经发展成为一种高效的外源蛋白基因优秀表达系统,该系统具有高表达、高稳定、高分泌、容易放大和成本低等优点,目前已有多种外源蛋白基因在该系统中实现高效表达,对巴斯德毕赤酵母表达系统的进一步研究将会促进其大规模的工业化应用。     

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键.毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质.简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展.     

Gene expression in yeast: Pichia pastoris.

Recent studies have shown the versatility and utility of the Pichia pastoris expression system. Improvements in strains have boosted the yield of proteins and peptides to the commercially feasible range. The Pichia pastoris expression system will soon be used to manufacture proteins for human clinical trials.     

毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展

毕赤酵母表达系统是近年来发展最为迅速的一种新型外源蛋白真核表达系统,被广泛应用于多种不同领域且成功表达了许多基因工程产品。高密度发酵技术已被广泛运用到毕赤酵母工程菌发酵工程当中。主要从毕赤酵母的表达常用菌株、载体及表型等方面介绍了其表达系统,从外源基因自身的特性、培养基的组成、温度、pH、溶氧量及补料流加策略方面阐述了对毕赤酵母高密度发酵的过程及蛋白质表达结果的影响,并对毕赤酵母工程菌高密度发酵进行了展望,为其今后的研究及应用提供借鉴。     

利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

随着基因工程技术的迅速发展,已有数百种外源蛋白利用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了成功表达。本综述了该表达系统的优点、系统的构成,外源基因转化该表达系统的方式及表达特点,阐述了该系统在生产外源蛋白上的广泛应用．并重点分析了影响外源蛋白在该表达系统中表达的因素及优化策略等。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白（CPVVP2）,用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母（Pichiapastoris）分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA—VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPVVP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPVVP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64．35kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPVVP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

不同接头的白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究

毕赤酵母作为比较成熟的真核表达系统[1],它具有许多优点,表达产物直接分泌到胞外,这有利于产物的分离纯化.白蛋白干扰素在毕赤酵母中表达的研究也具有很重要的意义.研究白蛋白与干扰素之间的接头蛋白不同对表达量的影响.通过重叠PCR构建不同接头的白蛋白干扰素重组子,然后分别用salⅠ酶切线性化,通过电转仪转入毕赤酵母SMD1168,在MD板上进行培养,分别挑取10个克隆进行甲醇诱导表达,筛选出表达量最高的一个.最后在相同的条件下,分别将表达量高的进行诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE鉴定,由于表达产物中有杂蛋白,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定融合白蛋白干扰素的表达量,由已知浓度的白蛋白干扰素标准曲线,可以计算出不同接头的白蛋白干扰素的表达量,这对工业化生产具有指导意义.     

毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。