中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库ESTs序列测定及生物信息学分析

前期我们构建了中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis,GSS)毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cD-NA)文库。本文从构建的GSSG-cDNA文库阳性重组子中随机挑选了216个单克隆进行5’端表达序列标签(EST)单向测序,获得了211条高质量的ESTs。生物信息学序列比对分析结果表明84个克隆为已知功能基因,29个克隆为未知功能基因,98个克隆为新基因,分别占总ESTs的39.8%、13.7%和46.5%。成功获得了GSSG的部分ESTs序列,为GSS蛋白活性组分基因的克隆、表达和功能研究奠定了一定基础。     

核苷酸切除修复基因XPA反义RNA表达载体的构建及其抑瘤功能

采用RT PCR方法扩增出 4 2 6bp着色性干皮病A(xerodermapigmentosumgroupA ,XPA)cDNA片段 (2～ 4 2 7bp) ,反向插入pcDNA3 1质粒构建XPA反义RNA表达载体 .经测序证实 ,该片段序列与XPAmRNA对应片段完全互补 .通过脂质体Lipofectamine 2 0 0 0将重组质粒转染肺癌A5 4 9细胞 ,RT PCR检测表明转染XPA反义RNA重组质粒能够抑制肺癌细胞XPAmRNA表达 ;MTT实验表明转染XPA反义RNA的肺癌细胞对顺铂敏感性增强 .本研究为深入探讨NER途径基因功能及临床克服肿瘤耐药提出了一个新的思路     

野生大豆种子cDNA文库的构建与分析

为了分离与鉴定野生大豆优良基因,以双高型优质野生大豆的近成熟种子为材料,采用裂解法提取了总RNA;以Oligo（dT）为引物,经SA—PMPS法分离出mRNA,反转录酶催化合成cDNA,并以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成cDNA第二链,双链cDNA经加接头等步骤,成功构建了野生大豆cDNA文库。文库的重组率约为93．7％,PCR检测重组克隆的插入片段平均大于1000bp,测序片断大于500bp,表明构建的近成熟种子cDNA文库质量较高,为进一步进行EST测序和全长克隆打下了基础。     

日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫cDNA文库的构建

用TRIZOL试剂盒分别提取日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA,完成第二链cDNA合成后,凝胶电泳回收500bp以上的片段并过柱纯化后,与载体λZipLox连接。体外包装后分别得到雌、雄成虫cDNA噬菌体表达文库。经测定雌、雄文库容量分别为3．74×106、3．28×106,重组比率均在96％以上,插入片段长度多在1kb左右。通过PCR技术,我们从文库中钓取到EGP、23kD膜蛋白、Actin和GCP的cDNA,其中GCP基因为低丰度表达基因。各项指标表明,我们成功构建了高质量的cDNA文库,可作为研究雌雄成虫基因差异及筛选保护性抗原基因的重要资源。     

日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫cDNA文库的构建

用TRIZOL试剂盒分别提取日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA,完成第二链cDNA合成后,凝胶电泳回收500bp以上的片段并过柱纯化后,与载体λZipLox连接。体外包装后分别得到雌、雄成虫cDNA噬菌体表达文库。经测定雌、雄文库容量分别为3.74×10⁶、3.28×10⁶,重组比率均在96%以上,插入片段长度多在1kb左右。通过PCR技术,我们从文库中钓取到EGP、23kD膜蛋白、Actin和GCP的cDNA,其中GCP基因为低丰度表达基因。各项指标表明,我们成功构建了高质量的cDNA文库,可作为研究雌雄成虫基因差异及筛选保护性抗原基因的重要资源。     

鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库的构建

鸡胚成纤维细胞(CEF)是研究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要细胞材料,而构建CEF的cDNA表达文库是筛选IBDV在CEF中的细胞受体,研究细胞嗜性的基础平台。采用Gateway技术构建CEF的表达文库,避免使用限制性内切酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。该技术将CEF的mRNA分离纯化后,以5′端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接Adapter,层析柱纯化,通过BP重组反应构建cDNA入门文库,其平均滴度为1.1×106cfu/mL,文库总容量为1.2×107cfu,平均插入片段为2243bp,重组率为100%。通过LR重组反应将入门文库转换为表达文库,经测定平均滴度为5×105cfu/mL,文库总容量为5.5×106cfu,平均插入片段为2411bp,重组率为100%。结果表明,所构建的文库具有较高的重组率和较大的库容量,可作为较高质量的文库来研究IBDV的相关基因,为研究病毒受体和病毒入侵途径,进一步了解IBDV的致病机理奠定了基础。     

人TRAIL 基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段(114～281氨基酸残基)并构建原核表达载体。方法:取健康人外周血提取总RNA,设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。结果:从外周血cDNA中扩增出501 bp的目的片段,测序结果证实成功构建重组质粒pGEX-6P-1/TRAIL。结论:成功构建TRAIL基因的原核表达载体pGEX-6P-1/TRAIL,为肿瘤细胞的凋亡研究提供理论依据。     

人FGF21原核表达载体的构建及重组蛋白表达

构建人FGF21(fibroblast growth factor,FGF)cDNA的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。提取人肝脏总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,构建其T载体进行保存。再构建重组原核表达载体pET-28a(+)-h FGF21,重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,在IPTG诱导下得到可溶性表达,采用亲和层析法纯化表达产物后,进行Western blot鉴定。成功构建重组质粒pET-28(+)-hFGF21,对其进行可溶性表达后成功纯化出his-hFGF21,经Western blot鉴定该融合蛋白可与FGF21抗体特异性结合。成功构建pET-28(+)-hFGF21,并可溶性表达his-hFGF21蛋白。     

野生大豆未成熟种子总mRNA的分离及其cDNA的分子克隆

用氯化锂沉淀法从野生大豆(G.soja)未成熟种子中制备总RNA,经oligo(dT)-纤维素柱亲和层析,获得总mRNA,在兔网织红细胞体系中表现出一定翻译活性。以总mRNA为模板,oligo(dT)_(12)(?)为引物,反转录酶催化合成第一链cDNA,RNase H-DNA聚合酶Ⅰ协同合成第二链cDNA。双链cDNA的长度大约为200—5000 bp,且不存在发夹结构。将双链cDNA修补后钝端连接到pUC 19质粒的Sma 1位点,转化E.coli JM107,获得800多个白色重组子克隆。快速电泳检测及酶切分析表明,多数重组子带有插入片段,其中3个重组子的插入片段长度大致为1700 bp、2600 bp和1400 bp。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.