体外传代对版纳微型猪骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白表达的影响

目的通过分离扩增版纳微型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)观察传代对慢病毒转染的绿色荧光蛋白(GFP)表达的影响。方法采集4月龄版纳微型猪的骨髓,在DMEM/F12培养液中分离间充质干细胞(MSCs),并根据其形态学、抗原标志表达和分化潜能给予鉴定。MSCs与GFP慢病毒载体共培养,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测传代后MSCs GFP表达率的变化。标记后传代至1、2、3、4代细胞间比较用非参数检验。结果采用直接培养骨髓,可以分离到高表达CD13、CD29、CD90、CD105的MSCs,并可诱导分化为脂肪、骨和软骨细胞。MSCs与携带GFP的慢病毒载体共培养3天即可观察到GFP的表达,最佳转染复数(MOI)值为50,最佳共培养时间为6 d。传代后MSCs GFP表达率呈下降趋势[1代转染率(42.3±2.25)%、2代转染率(41.6±2.65)%、3代转染率(41.4±3.75)%和4代转染率(38.2±4.75)%],但传至4代GFP表达率的变化差异无统计学意义(P0.05)。结论采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液可以从版纳微型猪骨髓中分离到MSCs,GFP慢病毒转染是标记MSCs的有效方法,连续传代4代不会显著影响GFP的表达。     

microRNA499 慢病毒载体转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞 向心肌样细胞分化*

目的:探讨microRNA 499(miR-499)慢病毒转染对诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)向心肌样细胞分化的作用。方法:取第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞进行流式细胞检测,鉴定干细胞表面特异标记物。使用符合干细胞鉴定标准的细胞批次用于后续实验。实验设置miR499慢病毒转染、慢病毒空白转染2个处理组,分别于处理后即日、1d,3d,5d,7d收集细胞进行下列实验:实时荧光定量PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,western-blot检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果:培养第四代Wistar大鼠骨髓来源间充质干细胞表达干细胞表面特异标记物,可用于实验。大鼠骨髓来源间充质干细胞microRNA 499慢病毒载体转染后microRNA 499表达明显升高,且转染后1d,3d,5d,7d,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。慢病毒空白转染组未见明显变化。western-blot检测自第3天开始可见cTnI阳性表达条带,慢病毒空白转染组未检测到明显阳性表达条带。结论:microRNA 499可诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

骨质疏松大鼠脂肪基质细胞成骨能力的研究

目的:探讨骨质疏松大鼠的脂肪基质细胞有无成骨能力。方法:采用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,设置2组样本,分别为19月龄骨质疏松SD雌性大鼠,正常19月龄SD雌性大鼠。每组大鼠分别取腹股沟脂肪垫中脂肪,用胶原酶消化法培养获得脂肪间充质干细胞,绘制并分析细胞生长曲线;再用经典的骨向诱导液诱导2组ASCs,比较2组细胞骨向分化能力有无差别。结果:骨质疏松大鼠与正常老龄大鼠的ASCs骨向分化能力无明显差别。结论:可用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,并可取其细胞行进一步研究。老龄骨质疏松大鼠的ASCs也可以考虑作为种子细胞促进其自体骨愈合,从而为利用自体ASCs促进骨质疏松骨愈合打下一定的理论基础。     

IGF-1 基因转染对脂肪间充质干细胞活性的影响及机制研究

目的:探讨携带IGF-1基因慢病毒转染脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的可行性,对其引起的细胞凋亡机制做出初步研究,并讨论其与PI3K/Akt通路的关系。方法:分离培养ADMSCs,利用脂质体将携带IGF-1基因的慢病毒载体转染入ADMSCs。实验分为Blank组,Lv-non和Lv-IGF-1三组,转染后用MTT法测定各组细胞的生长情况并绘制生长曲线,流式细胞术测定各组细胞凋亡,Western blot测定各组中IGF-1、Akt、p-Akt及凋亡相关蛋白的表达。结果:成功分离、培养了大鼠脂肪间充质干细胞;携带IGF-1慢病毒载体转染ADMSCs后,流式细胞术检测发现Lv-non和Blank组凋亡率明显高于Lv-IGF-1组(P0.05)。同时发现Lv-IGF-1组中促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9蛋白和Bax的表达水平显著下调(P0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2显著上调(P0.01)。MTT法结果显示Lv-IGF-1能促进细胞生长,在5到6天时显著高于其他两组(P0.05)。通过检测PI3K/Akt通路发现,Lv-IGF-1组PI3K和p-Akt水平显著高于Blank和Lv-non组(P0.05),通路被激活。结论:携带IGF-1基因慢病毒载体成功转染ADMSCs。在ADMSCs中过表达IGF-1蛋白可以促进细胞生长,同时抑制细胞凋亡,其机制可能与PI3K/Akt通路蛋白磷酸化相关。     

慢病毒介导EGFP转染骨髓间充质干细胞在胶质瘤模型中迁移分布的研究

目的:如何证实骨髓间充质干细胞(BMSCs)是胶质瘤基因治疗中最好的药物载体?将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植入大鼠C6胶质瘤模型脑内,观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的迁徙与定位。方法:贴壁法培养大鼠骨髓细胞获取纯化的BMSCs。慢病毒介导EGFP转染BMSCs,于荧光显微镜下观察EGFP的表达,并行流式细胞仪检测EGFP阳性转染率。利用立体定向仪将培养好的C6细胞注入大鼠脑内,建立大鼠脑内胶质瘤模型。将标记EGFP的BMSCs利用微量注射器注入模型鼠脑内;移植后第1,7天处死大鼠,用荧光显微镜观察BMSCs在肿瘤内的迁移分布。结果:实验成功建立了大鼠脑内胶质瘤模型。以EGFP标记的BMSCs在模型鼠脑内主动迁移分布于肿瘤内部及肿瘤与正常脑组织交界侧。结论:骨髓间充质干细胞可以作为肿瘤基因治疗的良好载体。     

慢病毒介导的GFP转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、细胞表型及脑脊液诱导后分化能力的影响

摘要 目的：研究慢病毒（Lentivirus）介导的绿色荧光蛋白（Lentivirus-GFP）转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的可行性及稳定性,以及对人脑脊液诱导转染后BMSCs（BMSCs-GFP）成神经分化能力的影响。方法：全骨髓贴壁法培养BMSCs,Lentivirus-GFP以5、10、30、50的感染复数（MOI）转染BMSCs,96h后倒置显微镜下观察GFP转染效率和表达情况,筛选最适MOI;流式细胞术检测细胞表型;CCK8法检测细胞活力。人脑脊液诱导BMSCs-GFP向神经细胞分化,蛋白印迹法检测神经细胞表面标记物MAP-2和Nestin表达。结果：全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs生长旺盛。MOI值为5、10、30、50的转染效率分别为56.2%、87.3%、94.7%和95.1%,当MOI为30时,Lentivirus-GFP转染BMSCs效率较高,且对BMSCs生长状态无显著性影响。BMSCs-GFP表达CD29、CD90,较少表达CD45、CD54,符合干细胞特性。BMSCs-GFP增殖活性与未转染GFP基因的BMSCs相比,差异无统计学意义（P>0.05）。人脑脊液诱导BMSCs-GFP成神经细胞分化后表达神经元标记物MAP-2和Nestin。结论：Lentivirus-GFP能高效稳定转染大鼠BMSCs（最适MOI值为30）,同时不影响其生物学特性,人脑脊液能诱导BMSCs-GFP成神经细胞分化。     

下调microRNA-34a增强对人脂肪干细胞成骨诱导分化作用的初步探索

目的:颅颌面临界骨缺损是整复外科常见疾患,常常给患者的身心带来障碍和压力。为解决骨形成不足这一难题,我们拟通过表观遗传修饰的手段,调节microRNA-34a在人脂肪干细胞中的表达,来探讨microRNA-34a对人脂肪干细胞成骨诱导分化的影响。方法:分离培养原代人脂肪干细胞,以慢病毒为转染载体,分三组对其进行上调、下调microRNA-34a的表达及阴性对照。然后对其进行成骨诱导培养,于诱导的第7天行碱性磷酸酶(ALP)染色,第14天行茜素红(Alizarin Red)染色,定性比较转染后人脂肪干细胞成骨诱导分化的效果。结果:成功分离和培养原代人脂肪干细胞,并以慢病毒高效率转染调控microRNA-34a的表达。对比碱性磷酸酶和茜素红染色可见下调microRNA-34a组成骨效率最高,其次是阴性对照组,上调组效率最低。结论:1.人脂肪干细胞通过慢病毒转染获得高效率的表观遗传修饰;2.下调microRNA-34a的表达对人脂肪干细胞成骨的诱导分化有一定的促进作用。     

脱细胞神经移植物对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探讨脱细胞神经移植物诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞的可行性。方法将分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增,行表型鉴定后,取第5代细胞,诱导组采用脱细胞神经移植物匀浆进行诱导,非诱导组加入等量无血清培养基,倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后细胞S-100,神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的表达情况。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,免疫细胞化学染色GFAP、S-100的阳性表达率分别为为(42±4)%和(64±5)%。结果 脱细胞神经移植物可诱导骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞。     

NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。     

过表达SCD1对骨髓间质干细胞成骨分化的影响及其基因表达谱变化研究

目的:研究固醇辅酶A去饱和酶1(SCD1)过表达后对骨髓间质干细胞(BM-MSCs)成骨分化作用的影响,并利用基因芯片技术分析基因表达谱的变化。方法:利用已构建成功的SCD1慢病毒转染BM-MSCs,采用RT-PCR及C14技术检测SCD1在BM-MSCs中过表达情况及其活性。成骨诱导培养BM-MSCs后,采用Western blot和茜素红染色技术检测骨钙素(OC)等相关成骨指标,进一步运用全基因芯片检测过表达SCD1对BM-MSCs成骨分化表达谱的影响。结果:SCD1在BM-MSCs中成功过表达,过表达组SCD1活性明显高于对照组。成骨诱导7天、14天时,过表达组中的碱性磷酸酶(APL)活性和骨钙素水平均明显高于对照组(P<0.05)。成骨诱导一周、两周时,过表达组的碱性磷酸酶染色和茜素红染色均多于对照组。基因表达芯片的结果显示,过表达SCD1改变骨髓间质干细胞表达谱,检测出差异基因2896个。基因通路分析提示干扰素通路为表达差异最显著通路(P<0.05)。结论:过表达SCD1可以促进BM-MSCs的成骨分化,可能通过作用于干扰素通路影响成骨分化功能。这一发现可能为骨折愈合提供重要的思路和潜在治疗策略,值得深入研究。     

茵陈四苓颗粒对肝衰竭环境下骨髓间充质干细胞分化及IDO蛋白表达的影响

目的:研究肝衰竭体外模型环境下茵陈四苓颗粒对骨髓间充质干细胞的肝向分化及IDO蛋白表达的影响。方法:通过建立肝衰竭血清、中药干预血清、健康血清分别与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养体系,检测BMSCs中CK18免疫荧光表达,Western-blot法检测甲胎蛋白(AFP)、肝组织白蛋白(ALB)、吲哚胺2,3—双加氧酶(IDO)蛋白表达。结果:1、CK18免疫荧光结果显示肝衰竭组及中药干预组染色均为弱阳性,但后者染色更强,而健康组无阳性染色;2、AFP、ALB在健康组、肝衰竭组、中药干预组均有表达,且各组间ALB比较均有差异(P0.05),三组AFP表达水平逐渐增高,各组间差异有统计学意义。IDO蛋白在健康组无表达,肝衰竭组表达低于中药干预组,且两组间差异具有统计学意义。结论:茵陈四苓颗粒能增强BMSCs在肝衰竭环境下的肝向分化趋势及免疫调节活性。     

BMSCs移植对视神经损伤家猫RGCs损伤及BDNF表达的影响

目的:探讨玻璃体腔内注射移植体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)对家猫视神经损伤后视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells, RGCs)的影响及其可能的作用机制。方法:参照标准化家猫外伤性视神经损伤动物模型建立的方法建立右眼视神经夹伤家猫模型,然后将其分为以下四组:(1)A组:右眼BMSCs注射移植组,玻璃体腔内接受注射移植BMSCs浓度为1×10~5细胞/μL的单细胞悬液0.1 m L;(2)B组:右眼PBS注射组,玻璃体腔内注射PBS缓冲液0.1 mL;(3)C组:假损伤控制组,BMSCs左眼组,仅暴露视神经而不损伤,不接受治疗;(4)D组:正常对照组,PBS左眼组,正常眼,不做任何处理。分别在移植后的3、7、14及28天,用免疫荧光染色双十八烷基四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐染色标记法观察分离视网膜的RGCs存活率,用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验方法检测分离视网膜的脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)的含量。结果:术后3、7、14及28天,在周边区及中央区视网膜上RGCs密度均显著减少(周边区:P3d=0.0446, P7d=0.0011, P14d 0.001, P28d0.001;中央区:P3d=0.0437, P7d=0.0067, P14d0.001, P28d0.001)。7天、14天、28天后,A组RGCs密度及BDNF含量均显著高于B组(P0.05)。结论:BMSCs移植可以减缓外伤性视神经损伤家猫RGCs凋亡,可能与其增加BDNF表达有关。     

CX3CL1 RNA干扰慢病毒载体的构建包装与鉴定

摘要 目的：构建包装趋化因子CX3C的配体1（CX3CL1）RNA干扰慢病毒载体。方法：参考目的基因CX3CL1序列,设计PCR引物扩增相应的干扰序列,然后将干扰序列连接至pLVX-shRNA2酶切后的线性化载体上,通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆,即为构建成功的pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒干扰载体。将构建好的慢病毒干扰载体同慢病毒包装载体共同转染293T细胞,收集上清,纯化浓缩后即为pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒。最后将慢病毒感染BMSCs细胞,QPCR检测慢病毒的干扰效率。结果：经过酶切能切出大小约为6500bp和1350bp的两条带,获得与预期结果相一致的DNA片段,并通过测序验证了序列的准确性,成功构建CX3CL1 RNA慢病毒干扰载体。然后经过包装、纯化浓缩后得到pLVX-shRNA2-CX3CL1慢病毒。QPCR结果表明干扰组明显抑制了CX3CL1mRNA的表达,干扰效率在70%以上。结论：成功构建包装CX3CL1干扰慢病毒载体,并证实其显著沉默了BMSCs细胞CX3CL1的表达,为CX3CL1在BMSCs移植的大鼠缺血性脑卒中炎症反应的机制研究奠定基础。     

UBE2T基因对结直肠细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨人类泛素结合酶E2T(Ubiquitin-conjugating enzyme E2T,UBE2T)基因对结肠细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外培养人正常结直肠粘膜细胞FHC,采用将UBE2T基因慢病毒质粒转染至FHC细胞48 h后,通过MTT法检测细胞增殖情况,western blotting检测细胞中增殖相关蛋白UBE2T蛋白、Ki67、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与转染空质粒的FHC细胞相比,UBE2T基因慢病毒质粒转染FHC细胞48 h后,细胞增殖能力显著上调(P0.05),UBE2T蛋白明显增加,Ki67的表达明显增加(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05),且Bax的表达明显下调而Bcl-2的表达上调(P0.05)。结论:UBE2T基因能够促进正常结肠粘膜细胞的增殖,并抑制其凋亡。     

Deleterious effects of endogenous and exogenous testosterone on mesenchymal stem cell VEGF production

Modulating the paracrine effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) may be important for the treatment of ischemic myocardial tissue. In this regard, endogenous estrogen may enhance BMSC vascular endothelial growth factor (VEGF) production. However, little information exists regarding the effect of testosterone on stem cell function. We hypothesized that 1) endogenous or exogenous estrogen will enhance stem cell production of VEGF and 2) endogenous or exogenous testosterone will inhibit BMSC VEGF production. BMSCs were collected from adult male, female, castrated male, and ovariectomized female rats. One hundred thousand cells were incubated with testosterone (1, 10, or 100 nM) or estrogen (0.15, 1.5, or 15 nM) for 48 h. Cell supernatants were collected, and VEGF was measured by ELISA. BMSCs harvested from castrated males, normal females, and ovariectomized females produced more VEGF compared with normal males. Castration was associated with the highest level (1,018 +/- 98.26 pg/ml) of VEGF production by BMSCs, which was significantly more than that produced by BMSCs harvested from normal male and normal female animals. Exogenous testosterone significantly reduced VEGF production in BMSCs harvested from ovariectomized females in a dose-dependent manner. Exogenous estrogen did not alter BMSC VEGF production. These findings suggest that testosterone may work on BMSCs to decrease protective growth factor production and that effective removal of testosterone's deleterious effects via castration may prove to be beneficial in terms of protective factor production. By manipulating the mechanisms that BMSCs use to produce growth factors, we may be able to engineer stem cells to produce maximum growth factors during therapeutic use.