Kruppel样因子4对内毒素所致IL-6基因表达的调控及机制研究

探讨Kruppel样因子4(KLF4)对内毒素所致白介素(IL-6)的基因表达以及释放的影响,并对其调控机制做了初步研究．使用RT-PCR和Western blot检测KLF4 mRNA和蛋白质的表达．采用KLF4过表达的RAW264.7巨噬细胞株或反义寡核苷酸技术抑制内源性KLF4的表达,用RT-PCR和ELISA检测内毒素(LPS)刺激后IL-6 mRNA和蛋白质的表达．采用荧光素酶报告基因检测RAW264.7细胞中KLF4过表达对IL-6基因启动子报告基因转录活性的影响．使用EMSA法检测细胞中KLF4与IL-6基因启动子区KLF4元件的结合．结果表明：LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞KLF4的表达以及IL-6蛋白表达．KLF4过表达明显抑制IL-6的mRNA和蛋白质的表达,而KLF4缺失使这种作用消失．荧光素酶报告基因的结果显示,KLF4可以抑制LPS所致的IL-6基因启动子的转录活性．EMSA显示KLF4不能与IL-6启动子区的KLF4结合元件直接结合．结果表明,LPS可以促进RAW264.7小鼠巨噬细胞KLF4的表达和IL-6的释放．KLF4能抑制LPS诱导的IL-6表达和释放,其机制是抑制IL-6启动子的转录活性,但KLF4的抑制作用不是通过直接与IL-6基因的启动子区相结合而实现的．     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

雌激素受体-α36 (ER-α36)介导乳腺癌细胞的顺铂耐药性

雌激素受体-α36 (estrogen receptor-α36, ER-α36)在乳腺癌细胞中对顺铂耐药性的作用和机制尚不清楚。本研究考察了ER-α36在乳腺癌细胞中的表达及ER-α36对顺铂耐药性的影响和机制。Western blotting分析显示,顺铂诱导人乳腺癌细胞MCF-7中ER-α36的上调。细胞计数8试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和细胞集落形成实验显示,过表达ER-α36显著提高了MCF-7细胞的增殖能力和集落形成能力,而敲低ER-α36则可抑制MCF-7细胞的增殖能力和集落形成能力。5μg/mL顺铂处理可激活EGFR/HER-2/ERK信号。敲低ER-α36可显著抑制MCF-7/DDP或MCF-7/ER-α36细胞中EGFR/HER-2/ERK信号的激活。抑制EGFR/HER-2/ERK信号可降低MCF-7/ER-α36细胞的增殖能力。总之,本研究证明ER-α36的上调通过激活EGFR/HER-2/ERK信号提高了乳腺癌细胞的顺铂耐药性。靶向ER-α36可能是提高顺铂敏感性的有效策略。     

癌基因MDM2对雌激素受体转录活性的调节作用

目的:检测MDM2基因对雌激素受体α和β(ERα和ERβ)是否具有转录活性调节作用。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增MDM2序列,并将其以正确相位与pcDNA3-FLAG载体中的FLAG序列融合,构建成重组质粒pcDNA3-FLAG-MDM2;以含雌激素反应元件的荧光素酶(ERE-LUC)为报告基因,通过检测荧光素酶活性来确定MDM2是否对ER有转录调节因子的作用。结果:克隆和表达了MDM2基因;MDM2只对ERα具有转录活性调节作用。结论:MDM2对ER转录活性的调节具有亚型特异性。     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

含p21启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p21基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p21启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果表明扩增的p21启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p21报告基因的转录。结论:克隆了p21启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

人乳腺癌雌激素受体协调激活因子ERIAP生物学功能鉴定

雌激素受体(ER)属于核激素受体(NR)家族成员, 是一种雌激素依赖性转录因子, 在乳腺癌的发生、发展和治疗中起重要作用. 协调转录因子(协调激活因子和协调抑制因子)在ER转导激素和代谢信号到靶基因时起着关键作用. 功能和结构研究阐明, 协调激活因子通过一个和数个LXXLL基因序列(X为任意氨基酸, L为亮氨酸, 也称NR盒)与ER受体上的激受诱导活化区域相互作用. 采用酵母双杂交系统, 确定了一种与ER-α相互作用的新蛋白质ERIAP(estrogen receptor-interacting and activating protein, 雌激素受体相互作用和活化蛋白), 该蛋白质含有两个LXXLL基因序列. 通过体内免疫沉淀和体外GST捕获方法分析, 证明ERIAP以雌激素依赖性方式与ER-α相结合. ERIAP蛋白中的两个NR盒对其与ER-α相互作用是必要的. 此外, ERIAP特异性提高雌激素诱导的ER-α转录活性, 并增强雌激素响应基因pS2的表达. 研究表明, ERIAP作为一新的ER-α转录活性协调激活因子, 可能在乳腺癌的发生和发展中发挥重要的作用.     

雌激素受体α真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体α（ERα）高效真核表达载体,并检测其转录活性。方法：用常规PCR方法特异扩增带有Flag标签的人ERα全长编码序列,经双酶切后将其克隆到真核表达载体pIRESpuro2中,构建重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERα;用Westernblot鉴定该重组质粒介导的Flag-ERα在人胚肾细胞株293T中的表达情况;用含雌激素应答元件的报告基因系统检测ERα的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERα重组质粒,该质粒介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含雌激素应答元件的报告基因的活性。结论：ERα高效真核表达载体的构建为进一步研究ERα在乳腺癌中的作用奠定了基础。     

BET蛋白通过调控NF-κB通路参与炎症基因转录

目的:探讨特异性抑制溴结构域(bromodomain and extra-terminal,BET)蛋白对血管内皮细胞激活与早期动脉粥样硬化形成的作用及其分子机制。方法:1.原代分离培养脐静脉内皮细胞和小鼠心脏血管内皮细胞后用肿瘤坏死因α(TNFα)刺激模拟炎症过程,以小分子化合物JQ1特异性抑制BET蛋白,分组如下:(1)对照组;(2)TNFα(25 ng/m L)处理组;(3)TNFα+JQ1处理组。采用Realtime-PCR及流式细胞术检测各组细胞炎症因子m RNA及蛋白水平的表达,采用5XκB荧光素酶报告基因检测各组核转录因子kappa B(NF-κB)转录活性。2.LDL受体基因敲除(LDLR-/-)小鼠随机分为2组:JQ1组(n=8,JQ1腹腔注射,50 mg/kg,每天一次)和对照组(n=8,DMSO溶媒组),同时给予高胆固醇饮食8周,采用免疫组化方法检测主动脉弓部血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达水平。结果:与对照组相比,TNFα组炎症因子m RNA、蛋白表达明显上调(P0.01),使用JQ1干预后,炎症因子E选择素(E-selectin)、P选择素(P-selectin)、VCAM-1及白细胞介素-8(IL-8)m RNA及蛋白表达均明显下调(P0.01)。LDLR-/-小鼠高脂饮食诱导8周后JQ1显著下调了主动脉弓部VCAM-1蛋白表达。5XκB荧光素酶报告基因结果显示,与TNFα(-)相比,TNFα(+)组荧光素酶报告基因活性增强,JQ1可以显著下调报告基因活性(P0.01)。结论:BET蛋白通过调控NF-κB信号通路参与了血管内皮炎症基因转录;抑制BET蛋白下调了NF-κB目的基因表达从而减轻了内皮激活及高脂诱导的早期动脉粥样硬化病理改变。