小鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养与鉴定

为探讨简便、高效的大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,本研究取新生24 h内的ICR小鼠大脑皮层,采用物理方法将其分成约1 mm^3,震荡过滤后进行培养。通过拍照的方式记录原代培养1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和原代培养14 d后再传代培养14 d(记为P2-14 d)细胞形态;通过实时定量PCR和Western blotting比较原代培养1周、2周、3周、4周、5周和原代培养2周后再传代培养2周(即P2-2)的星形胶质细胞内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因和蛋白水平变化。选取GFAP、S100-β和谷氨酸转运蛋白(excitatory amino acid transporter 1,EAAT1)标记星形胶质细胞,微管相关蛋白(microtubuleassociated protein 2,MAP-2)、离子钙接头蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1)和髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)抗体分别标记神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。通过免疫荧光染色鉴定细胞种类及纯度。研究结果显示细胞生长良好,原代培养4周星形胶质细胞内GFAP比2周、3周、5周和传代培养2周的细胞更加稳定。经免疫荧光鉴定,星形胶质细胞纯度在95%以上。本实验采用相对较简单经济的方法培养出高纯度且生理状态相对较稳定的原代星形胶质细胞,该细胞模型不仅可以用于星形胶质细胞生理功能研究,还可以用于中枢神经系统相关疾病的体外研究。     

恒河猴大脑皮质星形胶质细胞的原代培养及鉴定

为建立有效纯度高的恒河猴星形胶质细胞体外培养体系,无菌条件下取6月龄恒河猴婴猴的大脑皮质,除去白质,充分剪碎后机械吹打制成细胞悬液接种培养,待原代培养的细胞长满培养皿后,通过恒温摇床振荡和传代差速贴壁除去寡突胶质细胞、成纤维细胞等,得到纯化后的星形胶质细胞,并用GFAP-FITC(glial fibrillary acidic protein-fluorescein isothiocyanate)免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。分离培养的细胞具备典型的星形胶质细胞形态,并表达星形胶质细胞特异性抗原GFAP(glial fibrillary acidic protein),纯化后获得了高纯度的恒河猴星形胶质细胞。采用该培养方法成功建立原代恒河猴星形胶质细胞培养体系,为体外研究嗜神经性病毒、神经系统疾病及其相关中枢神经病理机制等提供了可靠的细胞模型。     

小鼠大脑皮质星形胶质细胞的原代培养及鉴定

为了体外分离培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞(astrocyte,AS)。取新生24 h内ICR乳鼠,超净台内断头取脑,体视显微镜下剥除脑膜、血管及海马,获得完整的大脑皮层组织,经手术刀切碎组织,旋涡震荡,过两次尼龙筛网以制备单细胞悬液,接种于35 mm塑料培养皿,倒置相差显微镜下观察细胞形态学状况,培养至3~4周,进行星形胶质细胞标记性蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光鉴定细胞纯度。本研究表明,倒置相差显微镜下观察细胞于接种后2~3 d大部分贴壁,生长至7 d左右即铺满皿底,3~4周细胞生长成熟,胞体较大,形状不规则,呈"铺路石"(cobblestone-like structure)状,免疫荧光鉴定可见GFAP阳性细胞占细胞总数比例达95%以上。通过以上方法可获得高纯度星形胶质细胞,为下一步实验提供大量生长状态良好的细胞。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,为下一步实验研究奠定基础.方法:采用密度梯度离心法获得骨髓单核细胞,接种后形成单层贴壁的成纤维样细胞.免疫荧光及PCR检测细胞表面标志及多能性基因的表达,并鉴定分离细胞的多向诱导分化潜能.结果:体外培养的原代细胞10天达到融合,传代后仍具有成纤维样的形态;免疫荧光结果见波形蛋白(Vimention)和Oct4标记阳性,CD45阴性;PCR分子检测见多能性基因OCT-4,nanog的表达;细胞具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力.结论:采用密度梯度离心法获得的pMSCs体外增殖能力强,纯度高,具有间充质干细胞的特性,pMSCs分离培养体系的成功建立为下一步实验研究奠定基础.     

无血清原代培养大鼠海马神经元的形态与膜电位

分离新生Wistar鼠海马,采用添加B27的无血清培养液进行海马神经元原代培养,动态观察海马神经元形态学变化;通过免疫荧光细胞化学法检测神经纤丝(NF)的表达,进行神经元鉴定及纯度计算;采用电位敏感的荧光探针标记神经元,在激光扫描共聚焦显微镜上动态监测去极化剂KCl作用前后膜电位的变化,观察神经元电生理反应。结果表明:此方法培养的大鼠海马神经元可在体外存活20天以上,9～14天为发育最成熟阶段,培养7天神经元纯度达90%。KCl作用于细胞后胞内荧光强度增强,细胞迅速去极化。本培养方法在体外获得高纯度的海马神经元并延长体外存活时间,且显示出神经元的电生理反应特性。     

树鼩脑星形胶质细胞的体外培养及纯化

本文旨在建立低等灵长类动物树鼩(Tupaia belangeri)脑星形胶质细胞(astrocyte,AS)原代培养及纯化的技术,为利用新型实验动物树鼩进行研究工作而建立体外模型。将新生树鼩大脑皮质机械分离,置于4°C冰箱20min以损伤神经元,皮质组织块用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液,分次贴壁去除成纤维细胞,培养的混合细胞在每次换液时用0.005%胰蛋白酶轻柔漂洗去除神经元。细胞长满培养瓶底面积约70%时,用0.025%胰酶溶液静置消化,至肉眼可见一层白色薄膜从瓶底脱落时终止消化,此白色薄膜即为AS层。AS传至第三代时,用抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体进行免疫组织化学染色和免疫荧光染色鉴定。结果显示,本方法所得的树鼩脑AS的纯度可达98%以上。该结果提示,这种通过分次贴壁法结合差异消化的培养及纯化技术可获得高纯度的树鼩脑AS,为建立神经系统疾病新的体外细胞培养模型打下了基础。     

SD大鼠乳鼠皮层神经元细胞原代培养模型的建立及鉴定

摘要 目的：探讨SD大鼠乳鼠皮层神经元细胞原代培养方法,并鉴定其培养效果,以期建立一种生物学功能良好的体外细胞实验模型。方法：取出生24 h的SD大鼠乳鼠,分离出大脑皮层,在胰酶消化之前先进行离心,然后将胰酶消化后多次离心得到的细胞悬液接种于L-多聚赖氨酸包被的培养皿和共聚焦皿中,以加B27的Neurobasal-A培养基进行神经元细胞的原代培养,倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态;通过免疫荧光组化的方法采用神经元标记物MAP-2进行神经元纯度的鉴定;在导入Fluo4-AM的原代神经元细胞,观察电刺激后胞内钙离子信号的变化,以验证神经元细胞的生理状态。结果：采用此方法培养的神经元细胞紧密贴壁、分散均匀、状态良好,神经元细胞周围突起相互连接形成网络;经MAP-2免疫荧光组化技术鉴定神经元的纯度达到95%以上;胞内钙离子信号的变化提示所培养的神经元具有良好的生物学功能。结论：该方法能获得纯度较高并且生物学功能良好的原代培养的SD大鼠乳鼠皮层神经元细胞。     

大鼠大脑皮质神经元原代培养不同培养体系及纯化方法的比较研究

目的:比较两种大鼠大脑皮质神经元的培养及纯化方法不同组合的优劣,探讨科学可靠的神经元培养纯化方法。方法:采用DMEM/F12+血清的有血清培养体系和神经基础培养基(Neurobasal)+B27的无血清培养体系培养原代神经元。在接种3天后分别采用加入阿糖胞苷和5-氟脱氧尿嘧啶两种方法进行神经元的纯化。在1天、3天、7天采用形态学及7天时免疫荧光化学法鉴定神经元的纯度及生长状态。结果:1天、3天时,有血清培养体系和无血清体系中的神经元的形态结构和密度无明显差别,在分别加入阿糖胞苷和5-氟脱氧尿嘧啶后,7天时无血清体系中加阿糖胞苷组细胞密度明显低于其他三组细胞密度。通过免疫荧光化学法鉴定可见无血清体系中的神经元纯度明显高于有血清体系。结论:有血清体系的神经元纯度较差,阿糖胞苷和5-氟脱氧尿嘧啶不能显著抑制胶质细胞等杂细胞的生长。无血清培养体系加阿糖胞苷的神经元细胞受损较多,无血清培养体系加5-氟脱氧尿嘧啶纯化培养的大鼠大脑皮质神经元,纯度较高,细胞数量合适,是体外研究神经系统相关理论的良好模型。     

柯萨奇B_3病毒感染体外培养神经元和星形胶质细胞的研究

为探讨柯萨奇B3病毒（CVB3）对体外培养神经元和星形胶质细胞的敏感性,用新中Balb／C鼠,生后24h内作为实验动物,摸索出体外纯培养神经元和星形胶质细胞的2种方法。纯培养神经无取材P／J‘脑皮质,用Balb／C鼠尾胶原作为生长基质,经阿糖胞书处理后,神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫织化鉴定,其纯度为85％～90％。纯培养星形胶质细胞取材于大脑皮质,用大鼠尾胶原作为牛长基质,经基述贴壁及传代培养处理后,胶质原纤维酸性蛋白质（GFAP）免疫组化鉴定其纯度为95％。100Th地。的C啊马分别感染可进行实验的纯培养的神经元和星影…     

RCMV感染星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

探讨大鼠巨细胞病毒（rat cytomegalovirus,RCMV）感染大鼠星形胶质细胞后,对神经干细胞分化的影响。原代分离培养新生大鼠星形胶质细胞和胚胎海马神经干细胞,将星形胶质细胞感染RCMV后和神经干细胞在Transwell24孔共培养体系下进行共培养,同时设对照组;用免疫荧光染色等方法检测神经干细胞与感染RCMV的星形胶质细胞共培养后,其分化细胞中神经元微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2,MAP2）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibril—lary acidic protein,GFAP）的表达。结果发现,感染RCMV的星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞分化减慢,分化成的神经元和星形胶质细胞比率低于对照组,提示星形胶质细胞感染RCMV后可抑制神经干细胞的分化,可能与RCMV影响星形胶质细胞合成和分泌各种营养因子,干扰了神经干细胞的分化进程有关。     

树鼩原代皮肤成纤维细胞的分离培养技术

建立稳定的树鼩(Tupaiabelangeri)皮肤成纤维细胞的体外培养体系,可为有关此类细胞的实验和疾病树鼩细胞模型提供技术支持。取树鼩大腿内侧皮肤用组织块贴壁法和胶原酶Ⅰ消化法分离皮肤细胞,胰蛋白酶差别消化法纯化细胞;用MEM(10%FBS)完全培养基和含低血清生长添加物(LSGS)的培养基培养细胞;免疫荧光和蛋白印迹法鉴定细胞,并测定细胞的生长、冻存和复苏特性。经树鼩皮肤细胞分离效果比较,胶原酶消化法比组织块贴壁法更适合用于树鼩原代皮肤细胞分离;对分离及冻存复苏后细胞生长状况观察比较发现,添加了LSGS的MEM培养基更利于细胞存活、生长;细胞形态观察、免疫荧光和蛋白印迹检测鉴定所分离的细胞为树鼩皮肤成纤维细胞。成功建立了树鼩原代皮肤细胞的分离、纯化方法,并优化了该细胞的培养条件。     

基于微流控芯片的体外血脑屏障模型构建

目的:利用微流控芯片技术构建易调控、接近在体微环境的体外血脑屏障模型。方法:微流控芯片体外模型采用上下双培养池结构,由多聚碳酸酯膜分隔,两套流路系统控制流体。细胞采用原代分离纯化的大鼠脑血管内皮细胞和星形胶质细胞,免疫荧光技术进行鉴定,分别按次序注入微流控芯片上下培养池,按1μl/min的流速进行灌注培养,构建体外血脑屏障模型,并对此模型进行鉴定和评价。结果:原代分离纯化得到两种细胞,免疫荧光法鉴定细胞纯度达95%以上。共培养3天紧密连接开始形成,5天达到峰值,超微结构观察显示内皮细胞之间形成紧密连接,且荧光素钠渗透实验和TEER值测量表明屏障形成良好。结论:成功构建微流控芯片体外血脑屏障模型,可成为一个新的平台应用于药物筛选、神经系统基础等多项研究中。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞条件培养液促进小脑皮质神经元的生长

本研究从大鼠大脑皮质分离、纯化星形胶质细胞,再经培养后收集星形胶质细胞的无血清条件培养液。用盖玻片培养法与快速自动比色微量分析法研究了星形胶质细胞条件培养液对小脑皮质神经元生存以及神经元活力的影响。发现星形胶质细胞条件培养液能够明显提高小脑皮质神经元的体外存活率,增强神经元的活力。表明星形胶质细胞具有神经营养性作用。     

芝麻素抑制NMDA诱导的小鼠皮层神经元损伤

目的:研究芝麻素对NMDA所致原代培养小鼠皮层神经元损伤的保护作用及其机制。方法:体外培养原代皮层神经元;免疫荧光染色鉴定细胞纯度;MTT法测定细胞存活率;Hoechst/PI双染色观察细胞凋亡的形态学变化;激光共聚焦显微镜技术观察钙成像,检测细胞内钙离子浓度变化;Western blot检测各组细胞中Bcl-2、Bax、NR2A、NR2B蛋白的表达。结果:NMDA(200μM)60分钟能使神经元细胞存活率显著下降,细胞凋亡百分比明显增加(P0.01),芝麻素(0.1μM)能提高细胞存活率,减少细胞凋亡(P0.01)。与NMDA组相比,芝麻素能抑制钙超载;降低Bax和NR2B蛋白表达;增加和Bcl-2蛋白表达(P0.01)。结论:芝麻素具有神经保护作用,这种作用可能与抑制钙超载、下调NMDA受体亚型NR2B的表达以及调节Bcl-2家族蛋白有关。     

大鼠BMSCs条件培养基对NSCs形态、生长及分化的影响

通过对SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)及新生鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行体外分离、培养及鉴定后,观察BMSCs条件培养基对NSCs向神经细胞分化的影响。采用全贴壁培养法培养BMSCs,并采用流式细胞术鉴定其特异性表面抗原标记。无血清技术培养NSCs,采用免疫荧光技术鉴定其特异性抗原标记。BMSCs条件培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养基)对NSCs诱导7 d后,镜下观察细胞形态和生长,并采用免疫荧光技术检测NSCs分化。BMSCs高表达CD90、CD29(90%),而CD45呈阴性表达。免疫荧光染色显示,NSCs标记蛋白Nestin、SOX2为阳性。NSCs经BMSCs培养液诱导分化7 d后经免疫荧光鉴定,MAP-2及GFAP呈阳性,阳性率分别为73.80%和50.47%;NSCs经胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)诱导分化7 d后经免疫荧光鉴定,MAP-2及GFAP呈阳性,阳性率分别为42.14%和31.90%。BMSCs条件培养基可诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中BMSCs分泌的细胞因子在诱导分化中可能发挥重要作用。     

树鼩原代小胶质细胞的分离培养、纯化与鉴定

本文旨在建立树鼩(Tupaia belangeri)小胶质细胞原代培养及纯化的方法,为利用新型实验动物树鼩进行相关研究工作提供实验材料。将新生树鼩大脑皮质机械分离,皮质组织块用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液;培养9～10 d后,分别采用直立手拍法、温和胰酶消化法以及恒温振荡法分离纯化树鼩小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化。荧光显微镜下,利用小胶质细胞的特异性标记物CD11b抗体进行鉴定。结果显示,小胶质细胞分离培养第3天时呈静息状态,表现为梭形、杆状、分支状等不规则形态。细胞免疫荧光CD11b呈阳性。不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示,直立手拍法所获得的细胞产量明显高于恒温振荡法(P 0.05),细胞阳性率( 96%)明显高于温和胰酶消化法( 90%,P 0.05)。直立手拍法可获得产量及纯度高的树鼩原代小胶质细胞。     

SD大鼠视网膜小胶质细胞原代培养方法的改良

目的对经典的原代视网膜小胶质细胞体外纯化培养方法进行简单的改良以提高细胞产量。方法在视网膜小胶质细胞原代培养过程中以McCarthy等的经典方法为基础,寻找适当的初始种植密度,并在初次振荡分离后继续培养以获得多次产出,使用免疫细胞化学染色方法进行小胶质细胞纯度鉴定。结果视网膜小胶质细胞原代培养最宜初始种植密度为1×106/mL,多次分离纯化获得的视网膜小胶质细胞均达到97%以上的纯度。结论视网膜小胶质细胞原代培养过程中,以适当的初始种植密度和多次振荡分离方法可在保证有效纯度的基础上提高细胞产量。     

大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养

为了建立大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型,探索纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法并进行形态学观察。采用2～3周龄的SD大鼠,解剖得到大脑皮质,两次酶消化及牛血清白蛋白或葡聚糖和Percoll梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于涂布基质的培养皿进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、透射电镜观察及Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测鉴定。结果发现,培养12h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,细胞呈短梭形,区域性单层生长,5～7天内皮细胞融合,内皮细胞纯度达90％以上;内皮细胞的贴壁和生长有赖于所涂布的基质,纤连蛋白／Ⅳ型胶原优于鼠尾胶和明胶;Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测内皮细胞表达阳性,透射电镜观察可见相邻内皮细胞间存在紧密连接结构。提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,可用于脑微血管内皮的生理、生化及药理学研究,亦可用于构建大鼠血脑屏障模型。     

大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)纯化培养及糖氧剥夺(OGD)模型的建立

目的建立大鼠脑少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)分离纯化培养及糖氧剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型。方法出生3d内的SD大鼠乳鼠取脑,经胰蛋白酶消化法培养混合胶质细胞,混合培养10d后,震摇及差速贴壁法分离纯化OPCs,纯化培养3d后鉴定、诱导分化OPCs为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL)及进一步OGD干预。免疫荧光法鉴定OPCs纯度及分化为OL的能力;MTT法检测OGD(37℃,1%O2,5%CO2)干预0.5h、1h、2h及4h时细胞活力改变,Edu染色检测细胞增殖情况。结果免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达NG2+A2B5,且可分化为MBP阳性的OL。OGD 2h时,MTT显示细胞活力明显下降,Ed U染色阳性率明显降低。结论震摇及差速贴壁法可获得高纯度的OPCs,且细胞具有分化为OL的能力。2h可作为OPCs OGD模型缺血缺氧损伤合适时间。     

小鼠气管平滑肌原代细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种可靠的通过组织块贴壁法分离培养原代小鼠气管平滑肌细胞及免疫组化鉴定的方法。方法体视显微镜下立体分离小鼠气管平滑肌组织,组织块贴壁法培养原代细胞,对分离培养细胞通过免疫组化方法进行鉴定,并用MTT法对其增殖特性进行检测。结果从BALB/c雄性小鼠分离气管平滑肌组织,剪碎为1 mm3,用含1%青-链霉素的PBS及培养液漂洗,使组织块贴于培养皿底,并加入5 m L培养液,放入37℃、5%CO2的细胞培养箱培养,3~5 d后有明显梭状细胞从组织块爬出,5~6 d后,细胞可见明显"峰-谷"结构。经免疫荧光鉴定,在传代、纯化后,可得纯度为99%以上的气管平滑肌细胞。用MTT法测量其生长曲线。结论本方法操作简单、经济,获得的气管平滑肌细胞具有较好增殖能力,细胞数量和纯度能够满足后续细胞生物学实验研究的需要。