转基因小鼠乳腺上皮细胞的体外培养及其对催乳素反应的研究

实现转基因生物乳腺反应器对外源蛋白的高效表达是目前生物制药亟待解决的难题。催乳素对泌乳期乳蛋白的合成与分泌具有重要的调控功能。通过转基因小鼠乳腺上皮细胞模型的建立,研究催乳素如何调控乳蛋白的表达,为提高乳腺反应器高效表达外源蛋白提供技术及理论支撑。应用机械破碎及胶原酶消化法,经差速贴壁纯化,成功培养含人转铁蛋白基因的小鼠乳腺上皮细胞,细胞上清液中检测到人转铁蛋白表达。细胞经牛催乳素诱导后人转铁蛋白的表达水平明显升高。利用转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,可以进行催乳素和环境因素等对乳腺上皮细胞合成及分泌蛋白能力影响的研究。     

重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究

为了提高胰岛素在酵母的分泌表达效率,首先合成了胰岛素原基因,并在其序列的N端引入了一段引导肽,构建成p PICZα-A-Pro-INS重组分泌型表达载体。将表达载体线性化处理后电击转化毕赤酵母GSll5感受态细胞,筛选获得分泌型高表达工程菌株,重组蛋白的表达水平为300 mg/L,占分泌总蛋白的40%左右。该结果表达明引导肽的存在对于在毕赤酵母中高效表达胰岛素的基因至关重要。     

人朊蛋白不同N-糖基化修饰突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

构建并表达人朊蛋白N-糖基化修饰位点突变的真核表达载体,有助于进一步研究朊蛋白N-糖基化修饰的生物学功能。定点突变野生型人朊蛋白基因PRNP,将获得的突变体亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,并在人宫颈癌细胞株HeLa中瞬时表达各种朊蛋白糖基化修饰位点突变体,利用免疫印迹和糖苷酶消化等糖蛋白分析方法鉴定表达产物的糖基化形式。经Western blot鉴定,野生型和突变型朊蛋白表达产物出现不同形式的泳动特征,分别出现特异性糖基化修饰的多个条带,单糖基化修饰的两条条带和无糖基化修饰的一条条带。经PNGase F糖苷酶消化,野生型和糖基化单点突变型表达产物均能被糖苷酶消化,其分子量下移,去糖基化突变型表达产物的分子条带位置不变。通过突变野生型人朊蛋白基因PRNP的N-糖基化修饰位点,获得单糖基化修饰和去N-糖基化修饰的6种人朊蛋白突变体,并能够在HeLa细胞株中瞬时表达单糖基化修饰和去N-糖基化修饰朊蛋白,为进一步研究朊蛋白的相关功能建立良好基础。     

FNDC5真核表达载体的构建及其N-连接糖基化修饰位点的预测

为构建小鼠FNDC5的真核表达载体p EYFP-N1-FNDC5,预测FNDC5的N-连接糖基化修饰位点。在质粒p EYFP-N1的多克隆位点插入小鼠FNDC5构建真核表达载体p EYFP-N1-FNDC5,用脂质体转染He La细胞。转染48 h后,用免疫印迹法检测融合蛋白的表达,使用激光共聚焦显微镜观察FNDC5融合蛋白的亚细胞定位。利用Net NGlyc 1.0 Server程序,预测FNDC5蛋白N-连接糖基化修饰位点。结果显示:与对照组相比,真核表达载体p EYFP-N1-FNDC5能够表达FNDC5融合蛋白,且FNDC5融合蛋白定位于细胞膜。FNDC5的Ⅲ型纤连蛋白结构域区存在两个N-连接糖基化修饰位点。上述结果表明FNDC5真核表达载体构建及表达成功,FNDC5存在N-连接糖基化修饰位点。     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ用pMAL-p2X载体的表达和纯化

虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ基因通过PCR扩增 ,插入pMAL p2X载体 ,基因 5′端插入凝血酶切割位点 .在大肠杆菌中经IPTG诱导高效分泌表达 .表达产物N端含麦芽糖结合蛋白 ,融合蛋白被分泌到大肠杆菌的胞间质 .经冷渗透休克后 ,透析脱盐 ,用凝血酶切割融合蛋白 ,再经SuperdexTM75分子筛柱层析、高效液相色谱反相C18柱纯化 ,得到重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅺ .质谱分析表明 ,rHWTX Ⅺ系正确表达产物 ,重组HWTX Ⅺ表现出与天然HWTX Ⅺ一致的生物学活性 .     

DMBA、垂体移植诱发性乳腺瘤内172^Arg—Leu突变型p53的特性及其与基因重排和扩增关系的研究

p53最早发现于SV40转化的细胞系,后来几乎在不同类型的细胞内均检测到这种蛋白质。野生型P58是一种有效的肿瘤抑制因子,但突变体p53可与ras－肿瘤原因协同转化体外的腺代细胞,而且在肿瘤发生时常伴随着p53基因的突变。乳腺瘤内,p53基因的突变率为40％,并可见到某些肿瘤基因参与癌症的形成过程,暗示p53基因结构和功能和改变可能与这些基因的重排和扩增有关。本实验选择4种不同年龄的172^Arg-Leu突变型p53转基因小鼠为受试动物,将同系动物的垂体腺植入小鼠的肾脏后,再以致癌剂DMBA处理,以使动物乳腺内的p53基因表达和诱导小鼠乳腺癌形成。从乳腺癌小鼠分别摘取乳腺组织,提取DNA和RNA,以H－ras、PCNA、CylinD1、p53基因的DNA片段作为特异性核酸探针,进行Southerm Blotting和Northern Blotting分析,以检测在突变体P53表达的情况下,PCNA、H-ras、CyinDl等基因在体内的变化规律,实验发现,在4组不同的受试动物中,其乳腺癌细胞的PCNA和H－ras两种基因发生了基因重排,特征是其DNA标本中分别出现了一条很强的额外杂交带,但对照动物乳腺该类基因以及被检测的肿瘤基因中均未发现结构上有任何改变。这表明,仅管内源性p53和突变体p53的高效表达抑制或延缓肿瘤的发生,但不能从根本上阻止PCNA和H－ras基因的重排。肿瘤基因的拷贝数及其表达的定量测定结果证明,虽然CyclinDl和H-ras基因在所有检测的小鼠癌组织和正常乳腺细胞均有扩增,但扩增的量极低,很难构为成肿瘤形成的主要因素。其他基因,如：MDM、PCNA等,也未见到明显改变。由于p53基因在转化细胞和肿瘤组织内的存在方式与基因扩增密切相关,乳腺癌小鼠体内的突变型p53的高效表达可能对基因扩增起到了抑制作用。最终,在一定程度上推迟了转基因小鼠的肿瘤形成过程。此外,致癌剂DMBA可诱发小鼠乳腺癌形成。其主要机制是使H－ras基因的第61位密码子发生突变。本实验证明,DMBA虽使垂体移植转基因小鼠发生了乳腺癌,但其作用点并非常见的第61位密码子,而是使H－ras基因发生重排,并使PCNA基因结构也发生同样变化。这种现象不仅是DMBA致癌方式上的新发现,而且表明该致癌剂的这种生物学效应可能与突变体p53的功能有关。     

人胰岛素原基因在酵母中的分泌表达

 我们研究了外源基因——合成的人胰岛素原基因在酵母α因子系统中的表达和分泌。用表达载体YTI-15转化酵母63号株可得到每升约2毫克的人胰岛素原分泌产物。     

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上     

乳腺生物反应器的表达优化策略

乳腺生物反应器是指将外源基因导入动物基因组并在动物乳腺中特异性表达,利用动物乳腺合成、分泌蛋白的功能,在其乳汁中获得外源蛋白的技术。乳腺生物反应器凭借其高表达、低成本以及合成蛋白质的结构接近天然蛋白质等优势而被视为药用和营养蛋白生产的一次技术革新,然而由于外源基因随机整合以及重组蛋白表达不稳定等问题极大地限制了其应用。本文结合乳腺生物反应器的发展现状,从利用基因编辑技术、筛选合适的外源基因整合位点以及改进外源基因调控序列3个方面对乳腺生物反应器优化策略进行了综述,以期为提高乳腺生物反应器生产重组蛋白的表达提供理论借鉴。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体,它能高效表达且有效地分泌表达产物,利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白,融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体。它能高效表达且有效地分泌表达产物。利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白。融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C的串联表达与活性检测

为克服抗菌肽易被蛋白酶降解及对宿主大肠杆菌的杀伤作用,并进一步提高大肠杆菌系统的表达能力,以棘胸蛙Paa spinosa抗菌肽Spinosan-C为研究对象,按照大肠杆菌密码子利用频率进行密码子优化,设计合成8拷贝的串联8×Spinosan-C基因,将合成的串联基因克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a,利用大肠杆菌感受态细胞Rosetta进行原核表达,获得高效表达的串联8×Spinosan-C重组蛋白,用甲酸专一性切割得到抗菌肽Spinosan-C单体。体外抑菌试验表明,切割后的抗菌肽Spinosan-C单体对测试菌生长具有抑制作用,为蛙类抗菌肽的规模化制备提供了参考。     

重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。     

人组织型基质金属蛋白酶抑制剂-1在Pichia pastoris酵母中重组表达研究

 为研究组织型基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMPs)的分子作用机制 ,探讨了在 Pichia pastoris酵母中高效表达分泌型人组织型基质金属蛋白酶抑制剂 - 1 (TIMP- 1 )的技术路线 ,并对产物性质进行初步研究 .通过 PCR从含有 TIMP- 1基因的 p BS质粒获得了该基因的全长序列 ,构建了 p PIC9/T1表达载体 ,电击法转化酵母 ,通过表型筛选和 PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入 Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS- PAGE表明表达量高达 40 mg/L培养上清 .用免疫印迹法确定了产物的正确性 ;同时 ,反向明胶酶谱法证明了重组蛋白具有抑制基质金属蛋白酶的活性 .     

miR-129-5p调节小鼠乳腺上皮细胞内Igf-1的表达

MicroRNAs(miRNAs)是一类大约22个核苷酸的非编码RNA.它能通过调控生长因子表达,引发肿瘤形成、细胞增殖和组织器官发育.本文通过构建miR-129-5p靶基因序列的双荧光素酶报告载体分析了miR-129-5p与靶基因之间的关系,应用脂质体转染技术和实时荧光定量技术观察了miR-129-5p在小鼠乳腺上皮细胞中的表达量及其变化,通过CASY细胞活力仪检测转染后的细胞增殖与活力变化,采用Western 印迹方法检Igf-1的变化.结果表明：miR-129-5p在小鼠乳腺青春期表达最高,成功构建了Igf-1基因 3′UTR荧光素酶报告载体, miR-129-5p抑制其荧光素酶活性（P <0.01）,转染抑制子后miR-129-5p表达降低（P < 0.01）,胰岛素样生长因子（Igf-1)表达增强（P <0.05）,细胞增殖和活力增强（P <0.01）,结果提示：miR-129-5p可能通过抑制靶基因蛋白Igf 1的表达,进而抑制小鼠乳腺上皮细胞增殖和活力.     

N-糖基化修饰对热休克蛋白gp96免疫学功能的影响

文中旨在以N-糖基化位点突变的重组热休克蛋白gp96为对象,研究N-糖基化修饰对其免疫功能的影响。首先利用昆虫表达系统表达野生型和突变型gp96蛋白,并检测其糖基化水平。进一步通过体外和体内实验,利用流式细胞术和酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 检测小鼠CD8+IFN-γ+ T细胞亚群和IFN-γ的分泌,查明糖基化对gp96抗原呈递功能的影响,进一步用ATPase试剂盒检测gp96的ATPase活性。最后通过小鼠免疫实验探究糖基化对gp96疫苗佐剂功能和活化流感疫苗特异性T细胞的影响。结果显示,N-糖基化修饰位点突变后,重组gp96蛋白总含糖量下降了27.8%。与野生型重组蛋白相比,突变gp96的抗原呈递能力减弱,同时ATPase活性明显降低。同时与野生型重组gp96相比,突变gp96佐剂活化流感疫苗特异性T细胞水平也明显减少。这些结果表明,N-糖基化修饰参与调节gp96的ATPase活性和抗原呈递功能,进而影响其疫苗佐剂功能,为开发基于gp96的佐剂疫苗提供了依据。     

抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器的制备与验证

目的:构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体并制备和验证抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型。方法:利用PCR法扩增出抗人p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L,然后分别将嵌合抗体重链基因H和嵌合抗体轻链基因L连接到乳腺特异性表达质粒pBC1,从而构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。分别将抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异表达载体pBC1-H和pBC1-L线性化,然后使用原核显微共注射法获得8只转基因FVB小鼠,通过鼠尾直接PCR鉴定其转基因阳性。通过RT-PCR、荧光定量PCR鉴定转基因小鼠乳腺组织中抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达。使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通过Western blot和夹心ELISA等实验鉴定抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26是否获得表达。结果:经测序验证,抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L分别与乳腺特异表达质粒pBC1正确正向连接。鼠尾直接PCR结果显示所获8只转基因FVB小鼠均为转基因双阳性小鼠,且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L在它们的后代中稳定遗传,它们的后代中转基因小鼠双阳性率约为30%; RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示,转基因双阳性小鼠及其双阳性后代的乳腺组织中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达; Western blot和ELISA等实验结果显示,转基因双阳性小鼠乳汁中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的蛋白质表达,而且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26与羊抗人κ链抗体和羊抗人Ig G Fc-HRP抗体均能特异性结合。结论:成功构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L和制备了抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型,为今后抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因牛乳腺生物反应器的研究奠定了理论和技术基础。     

20-HETE对小鼠葡萄糖刺激胰岛素分泌反应的影响

为了考察20-羟基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acids, 20-HETE)对葡萄糖刺激胰岛素分泌反应的影响,本研究选择CYP4F2转基因小鼠和小鼠胰岛素瘤INS-1E细胞作为研究材料,通过LCMS/MS检测WT和TG小鼠的胰腺20-HETE水平。通过IPGTT测定小鼠葡萄糖耐量,通过ELISA测定小鼠血浆C肽水平来检测胰岛素分泌。通过Western blotting、Real time PCR、免疫组化和免疫荧光来检测小鼠胰腺或INS-1E细胞中Glut2、GSK-3β(Ser9点)和AKT (Ser473点)的磷酸化水平。TG小鼠的20-HETE水平((7.26±2.03) ng/mg蛋白)显著高于WT小鼠((2.14±0.76) ng/mg蛋白)。在用20-HETE合成的选择性抑制剂HET0016处理后,TG小鼠((0.33±0.07) ng/mg蛋白)和WT小鼠((0.27±0.06) ng/mg蛋白)胰腺组织中的20-HETE水平均急剧降低。给予葡萄糖处理30 min后,TG小鼠的血糖水平均显著高于WT小鼠,而血浆C肽水平显著低于WT小鼠(p<0.05)。与WT小鼠相比,TG小鼠的胰腺组织中Glut2 m RNA和蛋白水平显著降低。与WT小鼠相比,CYP4F2转基因小鼠的GSK-3β和AKT磷酸化均显著降低。20-HETE处理可导致INS-1E细胞中AKT/GSK-3β磷酸化水平和Glut2表达水平显著降低(p<0.05)。此外,用17 mmol/L葡萄糖处理INS-1E细胞1 h,20-HETE处理组的胰岛素分泌显著降低。应用GSK-3β选择性抑制剂TWS119预处理INS-1E细胞3 h后,TWS119 (一种GSK-3β选择性抑制剂)预处理显著逆转了Glut2表达水平的降低以及胰岛素分泌的减少。20-HETE主要通过AKT/GSK-3β信号通路来下调Glut2的表达,进而减弱胰岛素分泌,导致胰岛素分泌功能障碍。     

hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究

旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平.在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得到该基因片段.与表达载体PET-30a连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶,羧肽酶B双酶切再过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,收集洗脱峰.对制备所得的胰岛素用SDS-PAGE,Western blot进行性质鉴定,及皮下注射小鼠测定生物活性.结果显示,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,表达产物以不溶性包涵体形式纯在,约占大肠杆菌总蛋白的30%.经Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为85%,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素.Western Blot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性.获得了一种高效生产基因重组人胰岛素的方法,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径提供了原料.     

249个氨基酸的人胰岛素原融合蛋白的表达

选Tac启动子,构建了以牛凝乳酶原B前161个氨基酸的多肽基因与人胰岛素原基因的融合基因的表达质粒pJG202,转化大肠杆菌JMl05,表达受IPTG及温度诱导。高表达时,按电泳扫描计算,表达的融合蛋白可占细胞总蛋白的20－35％。经CNBr裂解,S－磺酸解,初步分离S－磺酸型的人胰岛素原后再使之重组,可分离得人胰岛素原纯品,其氨基酸组成、生物活性与人胰岛素原标准相同。