人血管能抑素基因N端片段的表达、纯化及其生物活性测定

以中国人胎盘脐带组织为材料 ,提取组织总RNA ,用RT PCR方法合成人血管能抑素cDNA ,将该cD NA克隆进 pSP72载体获得重组质粒 pSP72C。以pSP72C为模板 ,PCR方法合成编码血管能抑素N端 189aa的基因片段 ,将其克隆进pET 3c载体获得重组表达质粒 pET CN ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,SDS PAGE分析显示 ,在IPTG诱导下 ,人血管能抑素N端基因片段获得了有效表达 ,表达量约占菌体总蛋白质的 35 .3% ,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白质复性以及SephadexG 10 0凝胶过滤层析等步骤纯化后 ,获得了纯度约92 .6 %的人血管能抑素N端片段 ,CAM实验证明具有显著抑制鸡胚新生血管生成活性。     

汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

汉森酵母(H.polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母,具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用PCR技术扩增汉森酵母甲醇氧化酶(Methanol oxidase MOX)基因启动子和转录终止序列,并与汉森酵母Leu基因(Hpleu2)和人血管生成抑制素基因一起重组进大肠杆菌质粒pSP72,构建了整合型表达载体pSMA17,采用LiAc法将pSMA17转入汉森酵母A16(leu),筛选出阳性转化子H.polymorpha A16(pSMA17)。转化子在YPGE培养基中培养至对数生长后期,用甲醇进行诱导表达。ELISA和SDSPAGE分析结果证明人血管生成抑制素已获表达,表达产物分泌至培养基中。Western blot结果显示重组的人血管生成抑制素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合,具有免疫原性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

斜纹夜蛾核多角体病毒p49基因在大肠杆菌中的表达及其在昆虫细胞中的表达时相分析

利用PCR方法从斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltMNPV）基因组中扩增获得了细胞凋亡抑制基因〖STBX〗p49〖STBZ〗的完整ORF并将其克隆于pMD18T载体,其序列分析结果与文献报道一致。将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体pThioHis C,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了稳定表达,表达的P49融合蛋白占菌体总蛋白30%左右,主要以包涵体形式存在。分离纯化重组表达的SpltMNPV P49蛋白作为抗原,免疫家兔制备得到效价高于1∶10000的抗重组P49蛋白多克隆抗体。应用制备的抗体对受SpltMNPV感染的Sl细胞中P49蛋白的表达时相进行分析,结果显示P49蛋白在细胞感染后3h内便可检测到,并在整个感染期间维持着低水平表达。     

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS21416中分离纯化出总RNA和mRNA,以AMV逆转录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有1507个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达99.6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

人Artemin cDNA扩增及表达

以人胎脑RNA为模板, 采用RT-PCR技术扩增人Artemin cDNA。序列分析表明, 扩增的人Artemin cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号：AF115765)同源性为99.7%, 氨基酸序列同源性为100%。将经过序列分析确定的Artemin cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中, 构建重组表达载体pGEX-6p-1-hART。通过SDS-PAGE分析重组人Artemin融合蛋白在大肠杆菌中的表达情况。结果表明, 重组人Artemin融合蛋白表达量约占宿主菌总蛋白的18.32%, 主要以包涵体形式存在。对表达的重组人Artemin融合蛋白包涵体进行溶解和复性, 并进行Western blotting分析。说明体外成功扩增人Artemin cDNA, 并在原核表达系统中高效表达了重组人Artemin融合蛋白。     

链激酶基因的分离和其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

从化脓性链球菌的染色体ＤＮＡ分离得到的目的基因片段定向插入载体Ｐｂｖ２２０中,获得有目的基因插入的重组质粒ＰｂｖＳＫ。双脱氧链终止法手工测序和Ｂｅｃｋｍａｎ自动测序仪分析Ｒｓｋ基因的全长序列,测序结果表明我们所获得的Ｒｓｋ基因与文献报道的基本一致。重组质粒ＰｂｖＳＫ转化受体菌Ｅ．ＣｏｌｉＤＨ５α株,温敏诱导后表达一个分子量约４７ｋＤａ的特异蛋白,其表达量为６０％。表达产物以包涵体的形式存在,包涵体经过洗涤、溶解和纯化后,最终纯度达到９５％以上。复性的重组蛋白用体外血块溶解法测定生物活性,结果表明我们所获得的Ｒｓｋ蛋白具有较好的溶解血块的活性,其比活性为１.３×１０^５ｕ／ｍｇ。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。     

小鼠canstatin及其N端片段在大肠杆菌BL21 中的表达

以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin及其N端片段基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin及其N端片段基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,分别构建表达质粒pET/Can和pET/Can-N, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达。结果表明: 小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。小鼠canstatin N端片段(1-95aa)与人的同源性为100%。 IPTG诱导原核表达载体pET/Can和pET/Can-N在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的35% 和 18%, 重组蛋白主要以包涵体形式存在。文中报道的小鼠canstatin 及其N端片段核苷酸序列已收入GenBank, 接受号分别为: AY375463和AY502946。Abstract:The mouse canstatin and its N-domain cDNA were amplified from total RNA of mouse liver by RT- PCR and cloned into vector pMD18-T for sequencing. Prokaryotic expression vectors pET/Can and pET/Can-N were constructed and expressed in E.coli BL21(DE3) with induction of IPTG.. Mouse canstatin cDNA is 684bp in length encoding 227 amino acids. The sequences of both cDNA and amino acids share high homology with human canstatin, with cDNA identity at 89% and amino acids identity at 96% to human canstatin. N-domain of mouse canstatin is the same amino acid sequence as that of human canstatin. In the present study, prokaryotic expression vector pET/Can and pET/Can-N were expressed in E.coli BL21 with amount of 35% and 18% of the total bacterial proteins after being induced by IPTG for 4h. The expressed products existed mainly as inclusion bodies. This work has laid down the basis for further study of its angiogenic activity and potential application for tumor dormancy therapy.     

重组小鼠canstatin N端片段对鸡胚新生血管生成的抑制作用(英)

为了研究重组小鼠canstatin N端片段的体内抗血管生成活性, 通过PCR扩增小鼠canstatin N端片段cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建小鼠canstatin N端片段重组表达载体pET-mCanN, 转化E.coli BL21(DE3), IPTG诱导表达,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹检测小鼠canstatin N端片段的表达. 结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-mCanN在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中高效表达, 小鼠canstatin N端片段表达量约占菌体总蛋白量的18%, 小鼠canstatin N端片段主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、裂解、Ni-spin column亲合柱层析以及蛋白质复性等步骤纯化后,获得了纯度约为92%的重组小鼠canstatin N端片段. 鸡胚绒毛尿囊膜(chicken embryo choriollantoic membrane,CAM)实验表明,原核表达的小鼠canstatin N端片段能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成.     

Recombinant mouse canstatin inhibits chicken embryo chorioallantoic membrane angiogenesis and endothelial cell proliferation

It is now well documented that the growth and meta-stasis of malignant tumors beyond a few mm3 dependlargely upon the formation of networks known as angio-genesis [1–3]. Several studies have shown that the tumormass can be restricted to within a certain …     

小鼠白细胞介素18在大肠杆菌中的表达、纯化及抗肿瘤作用研究

用RT PCR从小鼠肝脏细胞中扩增出小鼠白细胞介素 18(mIL 18)的cDNA ,克隆到表达载体pJW2中 ,经热诱导后在大肠杆菌JM109中表达。表达的重组mIL-18(rmIL-18)主要以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 18%。包涵体用 5mol L尿素溶解后 ,经SephadexG-100柱纯化。纯化的蛋白质经透析复性 ,在 0.5mg LConA存在的条件下 ,能够对小鼠脾细胞具有剂量依赖的IFN γ诱生作用。以 1× 105 H22 肝癌细胞腹腔注射昆明小鼠 ,构建小鼠H2 2 肝癌腹水瘤模型。分别在肿瘤细胞接种后 1、4和 8d ,用 10 μg纯化产物对荷瘤小鼠进行腹腔注射。结果显示rmIL 18注射组小鼠死亡速率延缓 ,生存率显著提高 (P <0 .0 1) ,达到 62.5 %。首次证明mIL-18对小鼠H2 2 肝癌具有显著的抑制作用 ,经rmIL 18作用后存活小鼠具有对H22 肝癌细胞的免疫记忆性     

人血管生成素-PE40融合蛋白基因的构建、表达及活性研究

利用 PCR扩增出人血管生成素 (h ANG)成熟肽的基因片段 .与绿脓杆菌外毒素缺失突变体PE40的基因连接后 ,克隆入 p UC1 9载体中 .测序后克隆入表达载体 p RSETB,构建成 h ANG-PE40融合基因的表达载体 .IPTG诱导 ,表达出分子量约为 58k D的 His6- ANG- PE40融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 8% .Ni2 +- NTA树脂纯化表达蛋白 ,SDS- PAGE结果显示纯化重组蛋白为单一条带 .鸡胚绒毛尿囊膜鉴定表明重组蛋白体外能够有效地抑制血管的形成 .     

转录因子CTCF的克隆、表达及其抗体制备

用RT-PCR方法从HeLa细胞总RNA中扩增转录因子CTCF的cDNA序列,克隆至pGEM-TEasy载体上。将CTCF蛋白N段的编码序列亚克隆至pET22b( )载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍柱进行亲和纯化。用纯化后的CTCFN段蛋白免疫家兔,获得CTCF的多克隆抗体,进而用于细胞内CTCF蛋白的免疫印迹检测。     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。