沙眼衣原体感染对大鼠早期妊娠的影响

目的检测沙眼衣原体(CT)感染后妊娠大鼠子宫内膜热休克蛋白70(HSP70)和整合素α4β1的表达,探讨CT感染对妊娠的影响.方法取正常未孕大鼠、阴道接种CT后妊娠大鼠和正常妊娠大鼠孕4～8d子宫作切片,采用免疫组织化学方法,研究CT感染对早期妊娠子宫HSP70和整合素α4β1表达的影响.结果 HSP70在未孕及妊娠大鼠子宫均有表达,其主要存在于子宫内膜固有层的基质细胞及蜕膜细胞,整合素α4β1存在于内膜上皮、腺上皮和基质细胞.CT感染后(实验组)妊娠大鼠子宫内膜HSP70的阳性表达在孕4～6d较正常妊娠组(对照组)及未孕组明显增强,差异有显著性(P< 0.01);在孕7～8d与对照组相比无明显差异,但强于未孕组.而整合素α4β1的阳性表达在孕4～6d弱于对照组(孕第5d尤为明显),强于未孕组,差异有显著性(P< 0.01).结论 (1)大鼠生殖道感染CT引起胚泡着床期(4～6d)HSP70的高表达,且主要存在于子宫内膜固有层的基质细胞及蜕膜细胞,内膜上皮、腺上皮中未见表达,推测CT生殖道感染可能影响母体子宫内膜蜕膜细胞的增殖,干扰妊娠,引起不孕或流产.(2)生殖道感染CT引起胚泡着床期整合素α4β1的低表达,并与HSP70表达的变化趋势相反,推测CT生殖道感染可影响孕早期胚泡植入,其不良妊娠结果可能通过HSP70与整合素α4β1的共同作用导致.     

p16INK4a在早孕小鼠子宫内膜的表达及其对胚泡着床的影响

本研究旨在检测肿瘤抑制基因p16INK4a(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4a)在早孕小鼠子宫内膜中的表达规律,探讨p16INK4a在小鼠胚胎着床过程中的作用.采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和免疫组织化学方法分别检测未孕小鼠及孕小鼠第2、3、4、5、7天子宫内膜p16INK4a mRNA和蛋白的表达;子宫角注射p16INK4a抗体观察胚泡着床数.FQ-PCR结果显示孕小鼠子宫内膜组织p16INK4amRNA的表达高于未孕小鼠,且随着妊娠天数的增加呈现表达逐渐增强的趋势,到妊娠第5天达到最高,后渐降.免疫组织化学分析显示p16INK4a蛋白在子宫内膜的表达规律与mRNA结果一致.子宫角注射p16INK4a抗体后胚泡着床数明显减少.以上结果提示,P161INK4a在妊娠早期子宫内膜持续表达,可能参与胚泡着床.     

PTEN在早孕小鼠子宫内膜的表达及其对胚泡着床的影响

本研究旨存检测肿瘤抑制基因PTEN(phosphatase andtensinhomologdeletedonchromosometen)在早孕小鼠子宫内膜中的表达规律,探讨PTEN在小鼠胚胎着床过程中的作用.采用实时荧光定量聚合酶联反应(real.time fluorescent quantitative PCR.FQ.PCR)和免疫组织化学方法分别检测未孕及孕1、3、4、5、7 d小鼠子宫内膜PTEN mRNA和蛋白的表达;子宫角注射PTEN反义寡核苷酸观察胚泡着床数.FQ-PCR结果显示,妊娠小鼠子宫内膜组织PTENmRNA的表达高于未妊娠小鼠,且随着妊娠天数的增加表达逐渐增强,到妊娠第5天达最高.免疫组织化学分析显示,PTEN蛋白在子宫内膜的表达规律与mRNA结果一致.子宫角注射PTEN反义寡核苷酸后胚泡着床数明显减少.结果提示,PTEN在妊娠早期子宫内膜持续表达,可能参与了胚泡着床.     

着床期小鼠子宫内膜中EGF及其受体转录和表达状况的研究

为探讨表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF)在胚泡着床过程中的作用。本文应用原位杂交和免疫组织化学方法,检测了EGE及其受体在胚泡着床前后小鼠子宫内膜中的转录和表达。结果显示：未孕和受精后第4-5天,子宫内膜表面上皮和腺上皮细胞仍呈EGF,EGFR原位杂交和免疫组化阴性着色,受精后第4-5天子宫内膜基质细胞EGF及其受体转录和表达较未孕期增强,受精后第6天,EGF及其受体免疫组化和原位杂交阳性着色主要分布于初级蜕膜带（primary decidual zone,PDZ);随着胚泡植入的进行,PDZ区蜕膜细胞EGF及其受体的转录和表达明显减少,而PDZ周围蜕膜细胞EGF及其受体的转录和表达增强,结果提示,EGF是小鼠胚泡着床过程中的一个重要调节因子。     

早孕小鼠子宫内膜M2型丙酮酸激酶基因表达的研究

该研究分析了M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)基因在早孕小鼠子宫内膜的表达规律。通过建立正常妊娠小鼠模型,收集孕D1、D4、D5、D6、D7小鼠子宫内膜组织及孕D5小鼠着床点及着床旁子宫内膜组织。构建假孕小鼠模型,收集假孕PD1、PD4、PD5、PD6和PD7小鼠子宫内膜组织。用Real-time PCR和Western blot方法检测PKM2 m RNA和蛋白质表达水平;免疫组织化学方法检测PKM2蛋白质在孕D5着床点与着床旁子宫内膜的分布。研究结果显示,在正常妊娠小鼠子宫内膜,PKM2 m RNA表达从孕D5开始出现明显升高,孕D6达高峰,孕D7略有下降,孕D6、孕D7与孕D1相比有明显差异。PKM2蛋白质从孕D6开始出现明显升高,孕D7略有下降,孕D6、孕D7与孕D1相比有明显差异。假孕小鼠子宫内膜PKM2 m RNA水平从PD6开始有明显升高,PD7与PD6水平相当,PD6、PD7与PD1相比有明显差异。PKM2蛋白质水平每两组间无明显差异。孕D5小鼠子宫内膜组织中,PKM2 m RNA及蛋白质水平均呈现着床点明显高于着床旁趋势。该研究初步揭示了PKM2基因在早孕小鼠子宫内膜表达规律,为深入探讨PKM2在维持早孕小鼠子宫内膜正常功能的机制上的作用提供了重要线索。     

过表达CD82对植入期小鼠子宫内膜整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin表达的影响

目的探讨CD82对着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3、E-cadherin以及β-catenin蛋白表达的影响。方法将构建的CD82腺病毒转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞。检测妊娠小鼠子宫内膜上皮细胞转染CD82腺病毒后,细胞内整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。结果提取的上皮细胞纯度为(93.2±0.6)%。构建的CD82腺病毒转染效率达到(92.0±4.5)%,转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞24 h后,RT-PCR检测发现CD82基因表达明显升高。转染48 h后,Western blot检测CD82蛋白水平明显升高。免疫细胞化学检测妊娠第4天的小鼠子宫内膜上皮细胞转染CD82腺病毒后,整合素αV、β3以及β-catenin的表达较未转染组均有明显上升(P0.05),但E-cadherin的表达量无明显变化(P0.05)。结论胚胎植入前,CD82可能影响小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3和β-catenin的蛋白表达。     

NF-κB在小鼠胚胎着床前植入期子宫内膜的表达研究

核转录因子NF-κB(nuclear factor of kappa B)是参与炎症反应的重要转录因子,而胚胎着床这一生理过程类似于炎症反应。该研究通过Real-time PCR、Western blot以及免疫组织化学等方法检测了妊娠小鼠孕第1天(d1)至第5天(d5)子宫内膜NF-κB的表达情况,并通过ELISA方法检测了妊娠小鼠(孕d1~d5)血清中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。研究发现,NF-κB于孕d1开始表达,且随着妊娠天数的增加表达呈现逐渐上升的趋势,其m RNA水平与蛋白质水平相一致。NF-κB在孕d5于子宫内膜表达着床点高于着床旁,而在假孕小鼠子宫内膜中NF-κB的表达低于真孕组,炎症因子IL-6与TNF-α的含量也随妊娠天数的增加表达逐渐上升。该研究结果表明,NF-κB可能通过炎症反应的过程参与了胚胎着床这一生理过程。     

自然发情与诱导发情小鼠子宫内膜中雌激素受体α表达的比较

目的从雌激素受体α(ERα)的角度探讨自然发情小鼠与诱导发情小鼠的子宫内膜上,雌激素受体α表达是否受内源雌激素的特异诱导而变化,两者之间是否存在差异。方法27只同日龄母鼠,根据处理方式的不同随机分为3个组:自然发情假孕组(对照组)、诱导发情处理假孕组和自然发情假孕第1天摘除卵巢组,3个组的小鼠在见栓后第4、6、8天分别取样后,采用免疫组织化学法观察小鼠子宫内膜中雌激素受体α的表达情况。结果免疫组化结果显示,3个处理组的小鼠子宫内膜上皮细胞核、胞质都有ERα存在,且主要表达在腺上皮;见栓第4、6、8天时,诱导发情处理组小鼠子宫内膜的ERα阳性率均显著高于自然发情组和自然发情第1天摘除卵巢组(P0.05);见栓第8天时,自然发情处理组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率与自然发情第1天摘除卵巢组差异不显著(P0.05),但见栓第4、6天时两者阳性率差异显著,自然发情处理组小鼠子宫内膜中的ERα阳性率显著高于自然发情第1天摘除卵巢组(P0.05)。结论诱导发情处理的小鼠子宫内膜,其表面雌激素受体α表达显著高于自然发情小鼠,且两者都受其内源性雌激素的特异诱导而变化。     

兔卵巢对着床前胚泡的识别

在17只母兔上,用放射免疫学方法对妊娠、假孕、假孕子宫中移植胚泡以及从妊娠子宫中冲去胚泡等情况下的周边血清孕酮浓度进行了测定。比较排卵后每日浓度的变化,借以探讨卵巢黄体能否对着床前胚泡进行识别。结果显示:排卵后第5天开始,妊娠兔的血孕酮水平与假孕兔就有了明显的差异,到第7天,前者血孕酮浓度增至第1天的6倍,而后者仅增3倍左右;将4天胚泡41只同步移植到5只假孕兔子宫,其中26只胚泡着床,血孕酮浓度于移植后第2天起即显著升高,以后逐日上升的趋势近似于妊娠兔所呈现的曲线类型;另从5只妊娠4天的子宫中冲去所有胚泡后,第2天孕酮上升趋势立刻减缓,曲线类型与假孕兔相似。上述结果说明:母体卵巢对已排出的卵是否受精和发育,早在排卵后第5天已能区分;对子宫里有无胚泡存在的反应也显然不同。为了观察卵龄对促黄体作用的影响,分别将2天受精卵和6天胚泡非同步地移植到子宫内膜和卵龄均相差2天的假孕4天子宫中,以了解不同卵龄卵的促黄体效应。结果显示:6天胚泡48只,移植后有24只着床,第2天血孕酮即明显上升;而40只2天受精卵,移植后没有1只着床,对孕酮的变化也未产生影响。由此可见,受精卵必须发育到一定阶段后才出现促黄体的作用。     

牛体内囊胚经体外共培养诱导子宫内膜上皮细胞整合素αv,β3基因差异的表达

目的利用牛体内胚胎与其子宫内膜上皮细胞体外共培养的方式,探究共培养前、后子宫内膜上皮细胞中整合素αv,β3基因差异表达的变化,为今后建立快捷有效的牛子宫容受态预判方法提供参考。方法将体内冲出的牛囊胚与原代培养并传代纯化至第5代的牛子宫内膜上皮细胞进行24 h体外共培养,利用RT-PCR技术对共培养前、后的子宫内膜上皮细胞进行αv,β3基因的表达检测。结果 RT-PCR检测结果显示,共培养前、后均有整合素αv,β3的表达;共培养I组(囊胚组),其共培养后诱导整合素αv,β3基因的表达与未共培养对照组二者之间差异无显著性(P0.05);共培养II组(孵化囊胚组),其共培养后整合素αv,β3基因的表达显著高于对照组和共培养I组(P0.05)。结论牛体内孵化囊胚经体外共培养诱导牛子宫内膜上皮细胞表达整合素αv,β3的效果,明显优于早期囊胚;整合素αv,β3基因具有作为牛子宫容受态体外检测标志的潜力。     

整合素及其在胚泡植入中的作用

整合素是一类由α、β亚基构成的异二聚体粘附分子,能够与胶原蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白等细胞外基质组分相互作用,调节细胞粘附和通讯.作为双向传递分子,整合素通过“胞内→胞外”和“胞外→胞内”两种方式介导细胞信号传递.成功的植入是侵入性的胚泡和接受性的子宫内膜相互作用的结果,整合素能够调节胚泡滋养层与子宫内膜之间的细胞-细胞及细胞-细胞外基质相互作用,是“植入窗口”期子宫内膜接受性的标记分子.     

早孕小鼠子宫内膜钙网蛋白的表达规律

采用RT-PCR、间接免疫荧光组织化学、Western 印迹及原位杂交技术分别检测未孕(d0)和妊娠d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7天小鼠子宫内膜中钙网蛋白(calreticulin, CRT)的表达规律, 探讨CRT在胚胎着床中的作用.结果显示CRT mRNA在妊娠小鼠子宫内膜中的表达明显高于未孕小鼠(P <0.05), 且随着妊娠天数的增加呈逐渐增强的趋势.间接免役荧光组织化学结果显示CRT表达于子宫内膜基质细胞、腺上皮以及腔上皮, 并在妊娠第4、5天基质细胞的胞浆中呈现高峰.实验结果提示, CRT在妊娠早期子宫内膜的持续表达, 可能通过调节整合素介导的细胞信号通路而调节胚胎滋养层细胞的黏附、侵袭, 参与胚胎着床.     

通过体内基因转染改变Meis1在围着床期小鼠子宫中的表达影响胚胎着床

通过宫腔内脂质体转染改变小鼠子宫内Meis1基因的表达水平,研究其对子宫内膜容 受性的影响,从而推测Meis1基因在胚胎着床中的作用.选择8～12周龄昆明小鼠,于妊娠 第2 ｄ,通过向小鼠宫腔内注入Meis1基因表达质粒和siRNA表达质粒及其各自的对照质粒 ,在妊娠第5ｄ, 提取小鼠子宫mRNA 和蛋白质行半定量RT-PCR 和免疫组化分析,观察各组小鼠子宫内膜Meis1和整合素β3的表达变化.在妊娠第9 ｄ,观察Meis1基因上调组及其对 照组、Meis1基因下调及其对照组妊娠率和胚胎着床数的差异.结果显示,Meis1基因下调组胚胎着床率明显低于对照组（P<0.05）,Meis1基因上调组胚胎着床率略高于对照组,但无统计学意义（P>0.05）;Meis1基因上调组其整合素β3的表达高于其对照组,Meis1基因下调组 整合素β3的表达低于其对照组,差异均有显著性（P<0.05）.以上观察结果表明,Meis1基因表达下降可明显减少胚胎着床率,影响整合素β3的表达.Meis1基因表达提高则可促进整合素β3的表达. 因此,Meis1可能作为1种子宫内膜容受分子,在胚胎着床中发挥重要作用.     

同期发情处理小鼠与自然发情小鼠子宫内膜中孕激素受体分布的比较

目的从孕激素受体（PR）的角度探讨同期发情处理与自然发情小鼠的子宫内膜上,孕激素受体分布是否受内源孕激素的特异诱导而变化,两者之间是否存在差异。方法27只同日龄母鼠,根据处理方式的不同随机分为三个组：自然发情假孕组（对照组）、同期发情处理假孕组和自然发情假孕第l天摘除卵巢组,3个组的小鼠在见栓后第4、6、8天分别取样后,采用免疫组织化学法观察小鼠子宫内膜中孕激素受体的分布情况。结果免疫组化结果显示,三个处理组小鼠子宫内膜的三种细胞中都有PR存在;见栓第4天时,同期发情处理组小鼠子宫腺上皮细胞和基质细胞的PR胞核阳性率显著高于自然发情组（P〈0．05）;见栓第6天时,同期发情处理组小鼠子宫内膜三种细胞中的PR胞核阳性率显著高于自然发情组（P〈0．05）;同时自然发情假孕第1天摘除卵巢组在见栓第6和8天时的阳性率均显著低于其它两组（P〈0．05）。结论同期发情处理的小鼠子宫内膜中孕激素受体分布显著高于自然发情小鼠,且两者都受其内源性孕激素的特异诱导而变化。     

前列腺素F（PGF）抗血清对小鼠胚泡着床的影响

本文试图利用自制的PGP抗血清,对小鼠子宫局部进行注射,以观察其对胚泡着床的影响。结果表明,于妊娠第3天(孕卵在输卵管阶段)单侧子宫角注射PGF抗血清,对胚泡着床无影响。而妊娠第4天(胚泡在子宫阶段〕单侧或双侧子宫角注射PGF抗血清,对胚泡着床均有明显的抑制作用。这一结果提示小鼠胚泡着床中PGF起着重要的作用。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及表达

构建人整合素β3亚基全读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合素β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础.根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序,序列分析表明与公布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,并通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达,经间接免疫荧光法检测证实pcDNA3.1-β3能在宿主细胞中高效表达.     

双炔失碳酯对兔移植胚泡着床的影响

本文用胚泡移植技术验证了双炔失碳酯对子宫内膜的影响是胚泡不能着床的重要原因。将 29只胚龄4d的兔胚泡移植到给药后假孕4d的子宫,结果没有一只胚泡着床;而对照组的5只受卵兔,移植了41只胚泡,有26只着床成功。 为了了解双炔失碳酯对黄体的影响,在5只妊娠兔上,从交配后1—7d与对照组比较血清孕酮浓度的变化,结果表明:对照组的血清孕酮浓度随着妊娠天数显著升高,妊娠第7天时达 17.35±2.12ng/ml,而给药组升高不明显,第7天仅 1.83±1.03ng/ml,为对照组的1/9。已知足够的孕酮浓度对妊娠的维持和胚泡的成功着床具有十分重要的作用。由此推测,双炔失碳酯抑制孕酮的分泌势必影响子宫内膜的发育,从而阻碍胚泡的着床。     

自噬抑制剂3-MA对围着床期小鼠子宫胚胎着床的影响

该文探索了自噬抑制剂3-MA对围着床期小鼠子宫胚胎着床的影响。将成年昆明雌性小鼠随机分为对照组、3-MA低剂量组(15 mmol/L)和3-MA高剂量组(30 mmol/L)。自小鼠孕D1起,腹腔注射自噬抑制剂3-MA,直到处死,以腹腔注射PBS作为对照。收集孕D4、D5、D6子宫内膜组织,Western blot检测自噬抑制剂3-MA注射后自噬相关因子Atg5和LC3蛋白表达,形态学观察对照组和3-MA自噬抑制剂组胚胎着床点数量。Real-time PCR检测Cathepsin B、P62、孕激素受体(PR)和雌激素受体α(ERα)m RNA在孕D5子宫内膜的表达。免疫组化检测PR在孕D5子宫内膜的表达。结果显示,在自噬抑制剂3-MA的作用下,自噬相关因子Atg5、LC3蛋白在孕D4~D6小鼠子宫中的表达量明显降低,Cathepsin B、P62 m RNA在孕D5小鼠子宫中的表达显著降低。注射3-MA自噬抑制剂后,孕D6小鼠着床点(IS)数量比正常组明显减少。在孕D5小鼠子宫内膜着床旁(IIS)和着床点中,自噬抑制剂3-MA干预组PR的蛋白质表达量明显降低,PR和ERαm RNA表达量均显著降低,随着3-MA抑制剂剂量的升高,PR和ERαm RNA表达降低得更显著。结果表明,自噬抑制剂3-MA可能会对小鼠胚胎着床时子宫内膜容受性产生影响,其机制有待进一步研究。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及表达

构建人整合素β3亚基全读码框（ORF）基因真核表达载体,为探讨整合素β3作为汉坦病毒（Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础。根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切的PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序,序列分析表明与公布的人整合素亚基ORF核苷酸序列基本一致,并通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达,经间接免疫荧光法检测证实pcDNA3.1-β3能在宿主细胞中高效表达。     

小鼠围着床期子宫内膜甲基化CpG结合域蛋白2的表达规律

为研究甲基化CpG结合域蛋白2（methyl-CpG binding domain protein 2,MBD2）在围植入期小鼠子宫内膜的表达规律,通过采用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）、Western blot和免疫组化技术检测未孕小鼠（d0）和不同孕天小鼠子宫MBD2的表达情况。qPCR结果显示,d0至d7的小鼠子宫内膜组织均有MBD2 mRNA表达,在d5至d7高表达。MBD2蛋白在子宫内膜的表达规律与qPCR结果相符。MBD2蛋白在孕d1到d4中度表达于腔上皮、腺上皮和基质细胞,在d5至d7基质细胞表达增强,主要表达于蜕膜区。假孕小鼠子宫内膜中,MBD2在腔上皮、腺上皮和基质细胞中中度表达,d5至d7基质细胞表达明显减弱。动物模型中,宫角注射MBD2基因反义寡聚脱氧核苷酸,可抑制MBD2的表达,降低人工诱导蜕膜化反应和蜕膜化标志物PRL的表达。MBD2在早孕小鼠子宫内膜的表达模式提示其可能参与了蜕膜化过程。