HCV 1a／1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a／1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Westem blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV) 1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达。结果证明,转染细胞中检测到分子量约70kDa的HCV NS3蛋白,转染细胞连续传20代,仍能检测到HCV正、负链RNA。表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制。HCV5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合。3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失“A”,9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入“TT”和“AAT”可不影响RdRp的生物活性。本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义。     

HCV 1a/1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

采用HCV 1a/1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,以免疫组化和Western blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA,研究丙型肝炎病毒(HCV)1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达.结果证明,转染细胞中检测到分子量约70 kDa的HCV NS3蛋白, 转染细胞连续传20代, 仍能检测到HCV正、负链RNA.表明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV 1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制. HCV 5′端非翻译区第11、12、13、34和35位核苷酸改变可不影响其与核糖体结合.3′非翻译区9400,9403和9407位核苷酸改变,9435位缺失"A",9409,9410位及9495,9496,9497位分别插入"TT"和"AAT"可不影响RdRp的生物活性.本研究对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义.     

嵌合型HCV全长cDNA的构建及体外转录制备感染性RNA的研究

构建HCV la/1b嵌合型全长cDNA克隆,进行体外转录,脂质体法转染HepG2细胞,以RT-PCR法检测HCV正、负链RNA,Western印迹检测HCV蛋白表达.结果表明,细胞在转染后8代(约35d)内,能间断检测到HCV正、负链RNA以及相对分子质量约70000的HCV NS3蛋白,证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达.本研究表明含有该嵌合型全长cDNA的质粒可以为后续HCV的研究提供大量可重复的性质均一的病毒模板,有助于深入了解HCV的复制机制.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因真核表达质粒的构建和表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中稳定表达.方法:采用RT-RCR方法从丙型肝炎患者血清中得到HCVC区的cDNA序列,然后克隆入pcDNA3.0载体,构建真核表达质粒pcDNA-HCV,并进行酶切鉴定和测序鉴定;采用脂质体转染技术将pcDNA-HCV稳定转染于HepG2细胞系,并用G-418进行筛选;采用Western Blotting方法和免疫细胞化学方法检测HepG2细胞中HCV核心蛋白表达情况.结果:从HCV感染者血清中扩增得到的503bpHCV cDNA序列.属于HCV 1型基因C区,并成功构建了真核表达质粒pcDNA-HCV.经Western blotting和免疫细胞化学检测,稳定转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白的表达.结论:成功构建HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA-HCV,并可以在真核细胞HepG2中稳定表达.     

HCV核心蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学特性分析

目的:表达HCV核心蛋白,为检测丙肝病毒提供合适抗原。方法:以含HCV核心全长cDNA克隆的pMD18T/core质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因,插入表达载体pQEN1构建重组质粒pQEN1/Core,转化BL-21(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:经SDS-PAGE及Western blot显示HCV核心蛋白在大肠杆菌中正确表达,融合蛋白分子量约为22 kD,表达量约占菌体蛋白总量的30%。纯化后的C蛋白能与慢性丙型肝炎患者有血清反应。结论:HCV核心蛋白在大肠杆菌中成功表达并具有较强的抗原性。     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

利用丙型肝炎病毒复制子模型检测重组人λ2干扰素的体外活性

目的:利用丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞模型,体外研究重组人λ2干扰素(hIFNλ2)对HCV复制子的抑制作用。方法:构建重组质粒pcDNA3.1-hIFNλ2-HA,转染293T细胞,表达带有HA标签的hIFNλ2,表达后的上清通过Western印迹检测,然后稀释至不同浓度后作用于带有HCV复制子的Huh7.5细胞系,每隔24h取样并更换培养液,通过报告基因检测hIFNλ2对HCV复制子的抑制作用。结果:构建了pcDNA3.1-hIFNλ2-HA真核表达重组体,并在293T细胞中表达出hIFNλ2,该蛋白能有效抑制HCV复制子的复制。结论:hIFNλ2对HCV复制子具有抑制作用。     

BLM解旋酶基因的克隆、表达载体构建及表达研究

克隆获得BLM基因全长CDS区,研究其在细胞中的表达情况。从人前列腺癌PC3细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,采用分段克隆的方法获得BLM全长CDS区,将其定向插入到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-N3,构建p ET-32a-BLM和p EGFP-N3-BLM。将获得的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞或转染PC3细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、荧光定位观察等方法研究人BLM解旋酶在细胞中的表达或定位。BLM解旋酶的原核表达结果显示,不同IPTG浓度对BLM解旋酶的表达量影响不大,低温有助于其表达量的提高。Western blotting检测发现,构建的人BLM解旋酶重组原核和真核表达载体分别能在大肠杆菌细胞和PC3细胞中表达出分子量约为179 kD的蛋白质,与预期分子量大小一致。荧光共定位结果显示,人BLM解旋酶主要定位在细胞核。成功克隆了人BLM解旋酶全长CDS区,且构建的重组表达载体pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM能在相应的宿主细胞中正确表达。