登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达

构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０＾６细胞（２４ｈ）,用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ,同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０＾６细胞（２４ｈ）     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ。同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。     

骨骼肌特异表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因载体的构建与验证

根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明...     

小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系的建立

用含有针对小鼠FSP27基因的siRNA慢病毒,感染小鼠前脂肪细胞系3T3-L1,建立小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系,为进一步研究该基因在脂肪细胞分化和脂肪代谢过程中的作用提供实验材料.根据小鼠FSP27基因设计双链siRNA,克隆至pSilencer2.1-U6质粒,形成含U6-siRNAbox的重组质粒.在293T细胞中检测siRNA沉默FSP27基因的效率,结果显示,siRNA可以高效地抑制外源小鼠FSP27的表达.将U6-siRNAbox重组到慢病毒载体FG12上,并将慢病毒载体与其他辅助载体用磷酸钙法转入293T细胞,包装成慢病毒.收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染靶细胞3T3-L1,检测感染效率和内源蛋白表达量的变化.结果显示,该siRNA可以高效地抑制内源小鼠FSP27的表达,并且siRNA插入基因组中,形成稳定表达.至此,小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系成功建立,为研究FSP27基因的功能提供了研究基础.     

小鼠2-细胞胚胎ATP合成酶6基因特异表达分析及鉴定

合子基因组活化是小鼠胚胎早期发育由细胞质调控向核调控转变的关键 .小鼠合子基因组活化发生在 2 细胞胚胎阶段 ,通过对 2 细胞胚胎阶段特异性表达基因的分析 ,可以从分子水平上揭示早期小鼠胚胎的发育机理 .用DD RTPCR技术 ,从单个小鼠 2 细胞胚胎与成熟卵母细胞 (MII细胞 )中分离了 2个差异片段 ,片段 2同小鼠睾丸中表达的一个未知片段具有高度同源性 .经过cDNA文库构建、筛选 ,分离到其全长cDNA .序列分析结果表明 ,该基因为小鼠ATP合成酶亚单位 6基因 .ATP合成酶亚单位 6基因由线粒体DNA编码 ,与细胞内ATP的合成相关 .小鼠 2 细胞胚胎特异表达的ATP合成酶亚单位 6基因可能与胚胎正常发育相关     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

c-myb基因启动子表观遗传修饰对该基因表达的影响

已有研究表明c-myb基因在白血病等癌症中发挥重要的作用,但是目前关于c-myb基因的调控机制尚不清楚。为了探究c-myb基因启动子区域表观修饰对该基因表达调控的作用,我们利用CRISPR-dCas9系统,在融合了p300和DNMT3A蛋白后,分别和靶向c-myb启动子的引导RNA (guide RNA, gRNA)共转染到小鼠急性髓系白血病M1细胞(mouse myeloid leukemia, M1)中,ChIP-qPCR结果显示dCas9-p300和dCas9-DNMT3A分别成功结合到c-myb基因启动子区域,并伴随有启动子区域组蛋白修饰H3K27乙酰化或DNA甲基化5-mC的显著增高。Western blotting及RT-qPCR结果表明d Cas9-p300使M1细胞中c-myb表达明显上调(p0.001),而d Cas9-DNMT3A使c-myb表达明显下调(p0.05)。进一步研究证明dCas9-p300可以对抗白细胞介素6 (interleukelin-6, IL-6)引起的c-myb基因表达下调。本研究结果证明c-myb基因启动子的表观遗传修饰可以影响该基因的表达,为研究白血病等癌症提供了新的治疗思路和方案。     

慢病毒介导Nanog基因在小鼠ES细胞的表达

试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物,引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞,通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因,小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中,PCR检测阳性的细菌克隆进行测序,测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中,包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞,在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后,添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。     

胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

乙型肝炎病毒3′末端缺失的preS/S基因在转基因小鼠中的表达

从乙型肝炎病毒adr亚型的基因组DNA中分离3′末端缺失的preS/S基因的DNA片段,构建了由CMV启动子控制的真核表达载体。采用受精卵显微注射方法,获得了基因组整合有3′末端缺失的preS/S基因的2个转基因小鼠品系。在不同的时间点采取血清进行了ELISA分析,发现在这2个小鼠品系中3′末端缺失的preS/S基因可被表达,而且呈稳定状态。此小鼠品系的建立,对于探讨乙型肝炎病毒3′末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间的关系有重要意义。     

MER-ERK信号通路调控H3K27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表达的研究

在人的某些癌症细胞中,组蛋白H3K27me3甲基化酶EZH2基因存在过表达的现象,很多研究已经证明,这可能是受MEK ERK信号通路调控的.为了确定这种调控模式在小鼠细胞系中是否同样存在,以及MEK ERK信号通路是否同时调控H3K27me3甲基化酶EZH1基因和去甲基化酶UTX、JMJD3基因的表达,用RT PCR和Western印迹方法检测不同浓度的MEK ERK抑制剂U0126（0、10、20、40 μmol/L）对C2C12、C127、NIH3T3三种小鼠细胞系处理后,EZH1、EZH2基因和UTX、JMJD3基因表达变化.结果显示：MEK-ERK抑制剂处理后,3种细胞中EZH1和EZH2基因的表达与对照相比都有不同程度的降低,其中EZH2基因表达变化在C2C12、NIH3T3两种细胞达到显著水平(P<0.05). H3K27me3去甲基化酶UTX、JMJD3基因在3种细胞中表达均有升高,JMJD3升高达到显著水平（P<0.05).因此,在小鼠细胞系MEK ERK信号通路可能参与调控EZH2、JMJD3基因的表达,但对EZH1、UTX基因的表达调控作用不明显.
关键词MEK ERK信号通路;     

小鼠M1细胞中ctcf基因的敲降及其对c-myb基因表达的影响

c-Myb转录因子能够调控造血细胞的分化和增殖,其转录调控受到多种机制影响。本实验室前期研究发现在小鼠急性髓系白血病M1 (Mouse myeloid leukemia)细胞中CTCF结合在c-myb基因上游调控区域,但是具体机制仍然不清楚。为了探索CTCF对c-myb基因转录调控的影响,本研究设计了针对小鼠ctcf基因的shRNA (Small hairpin RNA)干扰序列,并将其连接到载体pLKO.1中,得到ctcf-shRNA慢病毒干扰载体,测序验证后,与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.91、pCMV-VSVG共转染至HEK293T细胞中,经HEK293T细胞包装病毒感染小鼠M1细胞,通过RT-qPCR和Western blotting实验分别检测ctcf基因被干扰后,c-myb基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。RT-qPCR实验结果表明,含有ctcf-shRNA序列的慢病毒感染M1细胞后,ctcf基因mRNA表达量与对照组相比明显下降,同时检测到ctcf基因被敲降之后,c-myb基因的mRNA表达随之降低,Western blotting实验结果表明,当ctcf基因的表达被干扰之后,c-Myb蛋白的表达也明显下降。本研究发现c-myb基因的表达受到CTCF的调控,为进一步研究c-myb基因的表达调控机制提供实验依据。     

小鼠T-bet逆转录病毒载体的构建与功能验证

为在小鼠细胞中表达并研究T-bet功能,首先构建了含有报告基因Thy1.1的小鼠T-bet逆转录病毒载体,并将构建的载体质粒转染病毒包装细胞系包装成重组病毒,再利用重组病毒分别感染NIH-3T3和D9细胞系检测其感染能力。之后,使用该重组病毒感染T-bet敲除小鼠的CD4+T淋巴细胞,流式细胞术检测T-bet及其下游靶基因Ifng的表达情况。经验证,重组的逆转录病毒感染T-bet敲除小鼠T淋巴细胞后可以在细胞中表达T-bet,并进一步引起下游靶基因Ifng的表达上调,证明本研究中外源表达的转录因子T-bet具有正常功能。综上所述,本实验成功构建了含有报告基因的小鼠T-bet重组逆转录病毒载体,为进一步在小鼠细胞中研究T-bet功能奠定了基础。     

兔Oct4启动子驱动RFP基因表达载体的构建及验证

转录因子OCT4在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。Oct4基因启动子驱动标志蛋白的表达对研究胚胎干细胞多能性和建立iPs细胞有重要意义。由于GFP在慢病毒转染过程中常用作转染标记,计划构建兔Oct4基因启动子（rOct4）驱动红色荧光蛋白表达的载体,这将有利于兔ES细胞和iPS细胞制备的研究。通过PCR方法扩增rOct4,构建了rOct4驱动RFP基因的表达载体rOct4-RFP。经转染小鼠ES细胞验证正确后,将rOct4-RFP质粒转染兔成纤维细胞系获得rOct4-RFP成纤维细胞系。经过酶切和测序验证,证明rOct4-RFP构建成功,而且能够在小鼠Es细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白,并受细胞分化状态的调控。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOct4-RFP转基因成纤维细胞系。     

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A 细胞Tmub1 基因沉默及稳定感染细胞 系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。     

HBx与宿主蛋白质的相互作用

HBx是哺乳动物嗜肝性HBV的X读码框所编码的HBV中唯一具有多种调控功能的病毒蛋白质。这些调控作用包括：激活宿主细胞和病毒自身基因的转录、调控凋亡、抑制细胞中受损DNA的外切修复反应以及激活细胞中信号转导通路如：MAPK、JAK、STAT的级联反应等;HBx通过这样的多种调控作用直接或间接地对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程都产生了广泛的影响。     

小鼠resistin基因慢病毒表达载体构建及在KMB17细胞中的表达

[目的]构建携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体,并高效转导靶细胞。[方法]从小鼠脂肪组织提取总RNA,经PCR扩增、酶切、连接、转化后构建重组质粒;通过293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,然后感染KMB17细胞,检测小鼠resistin基因在靶细胞中的表达。[结果]PCR扩增到预期的342 bp大小的resistin基因目的片段;构建的重组质粒经酶切得到了342 bp大小的目的片段,测序鉴定为小鼠resistin基因序列;重组慢病毒包装可观察到很强的绿色荧光,说明具有较高的质粒转染效率;重组慢病毒感染KMB17后可检测到小鼠resistin基因转录水平和蛋白水平的表达,证明resistin基因得到有效转导并可在靶细胞中高水平表达。[结论]成功构建了携带小鼠resistin基因的慢病毒表达载体并可在KMB17靶细胞中获得高效表达。     

小鼠一个新基因mLPTS的克隆、表达及亚细胞定位

利用EST拼接技术,RT－PCR及DNA序列测定,首次成功克隆了小鼠新基因mLPTS。获得的mLPTS基因片段长1244bp,编剧了一个由332个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质与人的LPTS蛋白有78％的同源性,LPTS基因是本实验室通过定位候选克隆策略获得的一个新的肝癌相关基因。它在肝癌组织中不表达或低表达,并参与细胞生长的负调控。小鼠mLPTS基因在小鼠的各个组织中都有表达,与人LPTS基因的表达组织分布相同。分析比较了LPTS蛋白在不同物种间的序列同源性,发现LPTS在进化上是高度保守的,是一个具有重要功能的基因。将mLPTS基因与绿色荧光蛋白EGFP融合构建真核表达载体,在中国仓鼠卵CHO细胞中表达,发现mLPTS基因表达产物位于细胞核仁中,为进一步研究该基因的功能及作用途径提供了重要信息。