几种不同鹅膏菌毒素对真核生物RNA聚合酶Ⅱ抑制作用的比较研究

用鹅膏菌属含α－毒伞肽的毒素粗提液培养新鲜绿豆,结果在３６小时后,各种不同毒 的毒素粗提液培养的绿豆生长情况有明显不同,用紫外吸收法测定蛋白质含量,发现毒素粗提液培养的绿豆细胞中蛋白质含量比蒸馏水培养的有明显下降,这表明α－毒伞肽的作用机理确是通过抑制ＲＮＡ聚合酶Ⅱ而导致蛋白质合成减少。     

一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法——抑芽法*

低浓度（5-10ngml-1）的鹅膏毒肽(amatoxins) 能专一性抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性,高浓度（为RNA聚合酶Ⅱ103-104倍的浓度）也能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性,因而影响细胞mRNA的转录和蛋白质的合成,抑制种子的萌发和生长。根据此原理我们建立了一种以植物种子萌发试验检测鹅膏毒肽的方法,称之为“抑芽法”（bud-inhibited assay）。该方法简便、实用、准确。操作流程：45℃干燥至恒重的鹅膏菌等子实体菌盖;水提法提取毒素并用氯仿沉淀蛋白质等;粗毒液浓度为0.025-0.05gml-1干子实体;萝卜或绿豆种子培养温度为28℃,培养时间为24-72h。绿豆芽下胚轴生长被抑制率在95%以上,可能为鹅膏毒肽含量高的剧毒鹅膏菌;当被抑制率在60-80%,可能为鹅膏肽含量较低的微毒鹅膏菌;当被抑制率在30%以下时,可能是不含鹅膏菌肽的鹅膏菌。     

黑鹅膏菌（Amanita fuliginea）毒素的HPLC初步分离鉴定

本文了用反相高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）分离黑鹅膏实体内几种鹅膏毒素的结果,采用Ｃ１８液相柱,以不同浓度的０．０２ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵－乙腈混合液为流动相,从黑鹅膏子产体中分离并鉴定出了６种毒素,每公斤干重含量分别为（ｍｍｏｌ）：α－毒伞肽：５．１９ｍｍｏｌ;β－毒伞肽;１．１７ｍｍｏｌ;ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ;１．５ｍｍｏｌ;ｐｈａｌｌａｃｉｄｉｎ;０．４０ｍｍｏｌ;ｐｈａｌｌｉｓｉｎ;０．２６ｍｍｏｌ     

一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法--抑芽法

低浓度（5-10ngml-1）的鹅膏毒肽(amatoxins)能专一性抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性,高浓度（为RNA聚合酶Ⅱ103-104倍的浓度）也能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性,因而影响细胞mRNA的转录和蛋白质的合成,抑制种子的萌发和生长。根据此原理我们建立了一种以植物种子萌发试验检测鹅膏毒肽的方法,称之为"抑芽法"（bud-inhibitedassay）。该方法简便、实用、准确。操作流程45℃干燥至恒重的鹅膏菌等子实体菌盖;水提法提取毒素并用氯仿沉淀蛋白质等;粗毒液浓度为0.025-0.05gml-1干子实体;萝卜或绿豆种子培养温度为28℃,培养时间为24-72h。绿豆芽下胚轴生长被抑制率在95%以上,可能为鹅膏毒肽含量高的剧毒鹅膏菌;当被抑制率在60-80%,可能为鹅膏肽含量较低的微毒鹅膏菌;当被抑制率在30%以下时,可能是不含鹅膏菌肽的鹅膏菌。     

一种简便、快速测定鹅膏多肽毒素的方法—抑芽法

低浓度（5-10ngml^-1)的鹅膏毒肽（amatoxins)能专一性抑制RNA聚合酶Ⅱ的活性,高浓度（为RNA聚合酶Ⅱ10^3-10^4倍的浓度）也能抑制RNA聚合酶Ⅲ的活性,因而影响细胞mRNA的转录和蛋白质的合成,抑制种子的萌发和生长,根据此原理我们建立了一种以植物种子萌发试验检测鹅膏毒肽的方法,称之为“抑芽法”（bud-inhibited assay)。该方法简便、实用、准确,操作流程：45℃干燥至恒重的鹅膏菌等子实体菌盖;水提法提取毒素并用氯仿沉淀蛋白质等;粗毒液浓度为0.025-0.05gml^-1干子实体;萝卜或绿豆种子培养温度为28℃,培养时间为24-72h,绿豆芽下胚轴生长被抑制率在95%以上,可能为鹅膏毒肽含量高的剧毒鹅膏菌：当被抑制率在60-80%,可能为鹅膏肽含量较低的微毒鹅膏菌;当被抑制率在30%以下时,可能是不含鹅膏菌肽的鹅膏菌。     

云南楚雄致命鹅膏中环肽毒素的检测与分析

采用反相高效液相色谱法对采自云南楚雄双柏县的致命鹅膏在3个不同生长期中不同部位的6种环肽毒素含量进行了检测和分析。结果表明,致命鹅膏含有α-, β-鹅膏毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽,未检出γ-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽。生长期毒素总量最高（9.3mg/g）、从成熟期（7.5mg/g）到衰老期（6.5mg/g）逐渐降低,但鬼笔毒肽的相对含量随着年龄增长而逐渐增加,鹅膏毒肽与鬼笔毒肽比值从生长期、成熟期到衰老期分别为2.6、1.4和0.9。在3个不同发育阶段中,4种毒素含量从菌盖、菌柄到菌托逐渐降低,而鬼笔毒肽的相对含量逐渐增加。α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽在生长期菌盖中含量最高,分别为7.4mg/g和3.1mg/g,而羧基三羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽在衰老期的菌盖中含量最高,分别为2.8mg/g和2.1mg/g。     

α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的制备和鉴定

α-鹅膏毒(环)肽和二羟鬼笔毒(环)肽是剧毒的鹅膏菌和其它几种致死毒菌中由一些修饰氨基酸组成的环肽毒素.由于α-鹅膏毒肽对真核生物的mRNA合成的专一性抑制和和二羟鬼笔毒肽对肌动蛋白的专一性束缚,因而它们在分子生物学和细胞学研究中具有重要应用,对其需求逐步增加.为此,作者使用了一种改良的毒素提取方法,以制备高效液相色谱从灰花纹鹅膏菌中分离制备α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,并通过紫外吸收光谱和质谱进行鉴定,表明α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离效果好,纯度高.本方法对其它毒菌中的α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离制备具有同样的应用价值.     

α—鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的制备和鉴定

α-鹅膏毒（环）肽和二羟鬼笔毒（环）肽是剧毒的鹅膏菌和其它几种致死毒菌中由一些修饰氨基酸组成的环肽毒素,由于α-鹅膏毒肽对真核生物的mRNA合成的专一性抑制和二羟鬼笔毒肽对肌动蛋白的专一性束缚,因而它们在分子生物学和细胞学研究中具有重要应用,对其需求逐渐增加,为此,作者使用了一种改良的毒素提取方法,以制备高效液相色谱从灰花纹鹅膏菌中分离制备α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,并通过紫外吸收光谱和质谱进行鉴定,表明α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离效果好,纯度高,本方法对其它毒菌中的α-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离制备具有同样的应用价值。     

α—吡啶羧酸和致病毒素对水稻离体培养与幼苗生长的影响

比较了α-吡啶羧酸和稻瘟病菌粗毒素滤液对水稻种胚离体培养和幼苗生长的影响。结果表明,α-吡啶羧酸处理水稻种胚,其发芽率与愈伤组织诱导率明显降低,随α-吡啶羧酸处理浓度的提高,有逐步下降的趋势,感病品种(系)较抗病品种(系)更为敏感。α-吡啶羧酸处理不同抗病类型水稻的萌动种子,幼苗生长受到明显抑制,受抑制程度与处理浓度和品种感病性呈正相关。α-吡啶羧酸和病原菌粗毒素对水稻种胚离体培养与幼苗生长的影响基本一致。     

石楠拟盘多毛孢毒素产生条件初探

石楠拟盘多毛孢是引起草莓根腐病的优势病原菌之一, 本实验在明确该病菌毒素是主要致病物质的基础上, 利用叶圆片法对该菌的产毒条件进行了初步探讨, 结果表明, 除光照影响不明显外, pH值、温度、振荡及培养时间等对此菌产生毒素均有显著影响, 其最适产毒条件为：培养基初始pH值为自然pH值(约为6.2)、温度为25°C、黑暗、静置培养5 d~7 d。此外, 实验还发现该菌产生的粗毒素对玉米、黑麦和绿豆种子萌发、根或芽的延伸生长都有明显的抑制作用。     

温度对野蚕黑卵蜂寄主利它素的影响

利它素粗提液或涂利它素粗提液的人造卵经不同温度(25℃、60℃或100℃)处理30 min后进行生物活性测定,发现各温度下利它素仍对野蚕黑卵蜂有很强的引诱活性,其平均反应级数与常温(25℃)相比无明显差异,表现出一般蛋白质所没有的热稳定特性。低温 (4℃、0℃、-20℃或-70℃)同样也能保存粗提液中利它素的生物活性,但发现能引起粗提液发生凝集, 且0℃以下比4℃能产生更多的凝集, 使粗提液中利它素活性组分含量减少,-20℃时,其活性组分的峰面积仅为对照的13.1%,表现出一般蛋白质所没有的低温敏感性,这一发现对利它素的快速、简捷、有效分离具有重要的指导意义。     

我国鹅膏菌新发现种--致命鹅膏(Amanita exitialis)的肽类毒素分析

采用高效液相色谱(HPLC)技术对在广州发现的鹅膏菌新种——致命鹅膏(Amanita exitialis)不同组织部位的肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)的含量进行了分析,结果表明,致命鹅膏是一种剧毒蘑菇,其毒素含量相当高,子实体中组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,达8152．6μg／g干重,菌柄的毒素含量次之,为3742．3μg／g干重,菌托中的毒素含量最低,只有1142．5μg／g干重;在菌盖、菌柄和菌托中都以鹅膏毒肽为主,尤其以α-amanitin的相对含量最高,但从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽尤其是Phallacidin的相对含量依次增加。     

块磷鹅膏的培养条件及所产Amanitins毒素的分析

采集并组织分离到块磷鹅膏Amanita spissa的纯培养菌丝。探讨了各种培养条件对块磷鹅膏菌丝生长的影响,实验结果表明,在28℃,pH 6.0,避光的条件下块磷鹅膏的菌丝体生长最好。液体反应器人工培养块磷鹅膏获得成功,其液体培养的菌丝体干重在摇瓶中为0.893g/L,在气升式反应器内可达到2.33g/L。固体斜面培养和气升式反应器液体培养的菌丝体的HPLC分析表明菌丝体内含有鹅膏毒肽,而不含有鬼笔毒肽。两种培养条件下菌丝体的-αamanitin毒素含量略有不同,固体斜面菌丝体为26.02μg/gDCW、反应器培养菌丝体为15.25μg/gDCW。通过抑芽法试验也证明固体和液体培养菌丝体中含有-αamanitin,且具有和子实体中-αamanitin相同的生物学活性。结果表明有可能通过液体大规模培养鹅膏菌丝体来生产鹅膏毒素。     

鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制研究

研究鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的分子机制,利用分子对接方法获得了9种鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的结合模式、结合位点、对接能和抑制常数等信息,并对鹅膏毒肽的毒性与结构间的构效关系进行了考察。结果表明：利用分子对接方法获得的鹅膏毒肽与RNA聚合酶II相互作用的信息与实验结果相一致;不同R2取代基引起毒素与聚合酶II结合能力强弱不同,从而导致鹅膏毒肽分子间的毒性差异。结果证实了运用分子对接方法探索多肽分子与蛋白质相互作用的可行性,为在分子水平上研究多肽与蛋白质的相互作用开拓了新的思路。     

我国28种鹅膏菌主要肽类毒素的检测分析*

利用高效液相色谱(HPLC)技术对产于我国的28种鹅膏菌的主要肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)进行了检测分析,并和采于欧洲(德国)的毒鹅膏Amanita phalloides作对照,结果表明,3种东亚所特有的鹅膏菌(灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种)和欧洲毒鹅膏所含毒素种类多、含量高,其子实体菌盖部位主要毒素总量分别达到12583.7μg/g、8152.6μg/g、1058.2μg/g、7456.2μg/g干重子实体,这4种鹅膏菌可称之为剧毒鹅膏菌。其它25种鹅膏菌中有10种检测出含有微量鹅膏毒肽,含量在19.5μg/g-151.2μg/g之间。在4种剧毒鹅膏菌中,子实体组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,菌柄的毒素含量次之,菌托中的毒素含量最低;对于灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种,无论在菌盖、菌柄和菌托中,鹅膏毒肽类毒素的含量都高于鬼笔毒肽类毒素,尤其以α-amanitin的相对含量最高;而在欧洲毒鹅膏中,菌盖、菌柄和菌托中都以鬼笔毒肽为主,尤其以phallacidin的相对含量最高,并且从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽的相对含量依次增加。     

我国28种鹅膏菌主要肽类毒素的检测分析

利用高效液相色谱(HPLC)技术对产于我国的28种鹅膏菌的主要肽类毒素(鹅膏毒肽和鬼笔毒肽)进行了检测分析,并和采于欧洲(德国)的毒鹅膏。Amanita phalloides作对照,结果表明,3种东亚所特有的鹅膏菌(灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种)和欧洲毒鹅膏所含毒素种类多、含量高,其子实体菌盖部位主要毒素总量分别达到12583．7μg／g、8152．6μg／g、1058．2μg／g、7456．2μg／g干重子实体,这4种鹅膏菌可称之为剧毒鹅膏菌。其它25种鹅膏菌中有10种检测出含有微量鹅膏毒肽,含量在19．5μg／g—151．2μg/g之间。在4种剧毒鹅膏菌中,子实体组织部位不同,毒素含量以及鹅膏毒肽和鬼笔毒肽在其中的分布也不一样,菌盖中的毒素含量最高,菌柄的毒素含量次之,菌托中的毒素含量最低;对于灰花纹鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种,无论在菌盖、菌柄和菌托中,鹅膏毒肽类毒素的含量都高于鬼笔毒肽类毒素,尤其以α-amanitin的相对含量最高;而在欧洲毒鹅膏中,菌盖、菌柄和菌托中都以鬼笔毒肽为主,尤其以phallacidin的相对含量最高,并且从菌盖至菌柄到菌托,鬼笔毒肽的相对含量依次增加。     

7种鹅膏菌属真菌肽类毒素的HPLC分析

利用HPLC法对长白山地区分布的7种鹅膏属真菌成熟子实体中的α鹅膏毒肽(αamanitin)、β鹅膏毒肽(βamanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)的含量进行了测定。结果表明:芥橙黄鹅膏(Amanitasubjunquillea)和橙黄鹅膏(Amanitaaff.citrina)中均含有3种毒素,其中芥橙黄鹅膏的α鹅膏毒肽含量为2395.91μg/g、β鹅膏毒肽含量为1653.75μg/g和鬼笔毒肽含量为405.26μg/g;橙黄鹅膏的分别为1121μg/g、4244μg/g和9442μg/g。芥橙黄鹅膏白色变种(Amanitasubjunquilleavar.abla)中含有β鹅膏毒肽,其含量为614.00μg/g。其他5种鹅膏中均未检测到上述3种毒素。     

高效抗氧化大型真菌的筛选

为获得高效抗氧化菌株,采用直接提取方式从20个大型真菌菌株菌丝体培养液中提取抗氧化活性物质,采用邻苯三酚自氧化法、水杨酸法、DPPH法测定各菌株菌丝体培养粗提液对超氧阴离子自由基(O2)、羟基自由基.(OH)及1,1-二苯代苦味酰基自由基(DPPH-)的清除作用。结果表明:各菌株菌丝体培养粗提液对(O2)、.OH及DPPH-均有一定的清除作用,其中菌株NG菌丝体培养粗提液对OH-的清除效果最好,清除率为75.56%;菌株02菌丝体培养粗提液对(O2-)的清除效果最好,清除率为37.51%;菌株EG菌丝体培养粗提液对DPPH-清除效果最好,清除率为66.91%。     

雌性和雄性虎纹捕鸟蛛粗毒蛋白质含量比较分析

自然界虎纹捕鸟蛛雌蛛数量远多于雄蛛数量,为了探究雌、雄蛛粗毒的差异,用不同方法比较了单个虎纹捕鸟蛛雌、雄蛛粗毒的特征.雌蛛单次螫毒量为(26.5±2.47)μL,冻干后粗毒质量为(5.01±0.78)mg,明显高于雄蛛单次螫毒量(10.83±1.35)μL,冻干后粗毒质量(2.05±0.17)mg;用Lowry法和Bradford法测定雌蛛和雄蛛粗毒的蛋白质含量,两种方法均表明雄蛛粗毒中蛋白含量高于雌蛛.用反相高效液相色谱分离雌蛛和雄蛛粗毒蛋白,并215 nm检测色谱图,发现大部分洗脱峰重叠,而雄蛛色谱图中多两个主峰.Tricine SDS-PAGE电泳分析表明雌蛛粗毒相对分子质量小于10 kD的蛋白质含量较高;而Tris SDS-PAGE电泳分析表明雌蛛粗毒相对分子质量大于10 kD的蛋白质含量较低,基于雌蛛和雄蛛粗毒蛋白含量的差异,有必要对虎纹捕鸟蛛雌、雄蛛粗毒进行独立研究.     

大丽轮枝菌毒素的分离、提纯及生物测定

试验用Czapek's培养液培养大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)不同致病力类型的5个菌株的培养滤液,经浓缩、离心和透析制成的粗毒素,再经DEAE-纤维素柱层析得到初提毒素,最后通过琼脂糖凝胶过滤层析获得纯毒素样品。生物活性测定表明初提毒素的最低生物活性浓度为5.0—5.5μg/ml。纯毒素的最低生物活性浓度为4.0—4.5μg/ml。配制相同浓度的不同致病力类型菌株的毒素液,它们的培养滤液、粗毒素或纯毒素对棉苗的致萎能力相同。