间斑寇蛛 L.tredecimguttatus粗毒抗血清制备及其活性分析

间斑寇蛛Latrodectus tredecimguttatus是世界上毒性最强的蜘蛛之一,其毒液中含有许多大分子物质,可用于制备抗血清。将粗毒过滤除菌后作为抗原,加弗氏佐剂背部皮下免疫豚鼠。加强免疫3次后经检测抗血清效价达到1：8,再次加强免疫后断颈处死豚鼠放血,分离血清,经饱和硫酸铵分级沉淀及阴离子交换柱层析纯化后,采用westernblot法检测抗体所在峰。离体大鼠输精管电刺激收缩反应实验及活体动物给药实验均表明抗体对毒素具有明显的中和作用。特异性间斑寇蛛毒素抗血清为治疗间斑寇蛛咬伤奠定了基础。     

间斑寇蛛(L.tredecimguttatus)室内饲养及活体采毒方法的初步探讨

间斑寇蛛Latrotectus tredecimguttatus是目前已知毒性最强的蜘蛛之一,为了解决间斑寇蛛毒素研究中毒素来源有限的问题,本实验室开展了间斑寇蛛的室内人工饲养与采毒方法的研究,着重探索影响室内饲养间斑寇蛛生长发育、成活率及繁殖力的主要因素及活体采毒方法.结果表明,温度、湿度和食物种类等多种因素都影响湖南一带室内饲养间斑寇蛛的效果,但相对而言,空气的相对湿度是最重要的因素.与同批次的雌、雄蛛交配比较,利用前批次雌蛛与相隔30天左右的后批次雄蛛交配更有利于产卵率的提高.间斑寇蛛幼蛛度过适当长度的"卵袋期"对于以后的成活与生长发育,尤其是早期的成活与生长发育来说是必要的.尽管有多种方法可用来进行间斑寇蛛的活体采毒,但电刺激采毒法是最佳的活体采毒方法.     

间斑寇蛛粗毒的生物学特性

近几十年来,间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus)已引起相关研究工作者的广泛关注,因为阐明其毒液中的特异性蛋白质和多肽活性成分对蜘蛛咬伤治疗具有重要的意义,且其粗毒液中的生物学活性成分在神经生物学和药物研究方面也有着潜在的应用前景。但直到现在,尽管已有不少研究报道了包括α-latrotoxin在内的几种间斑寇蛛毒性蛋白质的生物学性质和结构,但有关毒液生物学特性的系统研究的报道还很少。本研究采用解剖分离毒囊的方法从产于我国新疆的间斑寇蛛提取粗毒,并对其理化和生物学性质进行了系统的分析。定量测定结果表明,粗毒的蛋白质含量为36.99%,对小鼠和蜚蠊的LD50分别为0.39mg/kg和2.32μg/g体重。小鼠经腹腔注射粗毒后,出现呆滞、共济失调、排汗、痉挛、食欲减退、呼吸短促、睁眼困难等中毒症状,而注射生理盐水的对照小鼠活动正常。粗毒具有透明质酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脱氧核糖核酸酶、乙酰胆碱酯酶、蛋白水解酶等多种水解酶的活性。10μg/ml该粗毒可以在31min±3.05min内完全抑制电刺激引起的大鼠输精管的收缩反应。6μg/ml粗毒可在25min±2.2min内完全阻断小鼠膈神经-膈肌标本的神经肌肉接头传递。膜片钳电生理实验显示,粗毒(1g/L)对蜚蠊背侧不成对中间(Dorsal unpaired median,DUM)神经元的快瞬时钾电流、钠电流、高电压激活的钙电流和大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞延迟整流钾电流、TTX-S型钠电流、高电压激活的钙电流均无明显作用。     

间斑寇蛛幼蛛过冬及其早期饲养管理

间斑寇蛛幼蛛过冬和早期饲养管理是人工饲养的关键。通过比较不同保存温度和不同保存时间下过冬幼蛛的孵化率、存活率和平均体质量,研究了间斑寇蛛幼蛛过冬的规律,并探讨了相对湿度、环境温度和食物种类对幼蛛离开卵囊后的早期生长发育的影响。结果表明:4℃左右是比较理想的卵囊保存过冬温度,但在此温度下保存7个月后存活率开始下降,到13个月幼蛛存活率降为零;卵囊放入低温保存前需在室内放置一段时间(约2个月)以使卵粒孵化成幼蛛;4℃左右下过冬的幼蛛离开卵囊后,在相对湿度55%~60%、环境温度25℃~30℃的条件下,用黄粉虫喂养4周后体质量增长40余倍,成活率达80%以上。     

雌性和雄性虎纹捕鸟蛛粗毒蛋白质含量比较分析

自然界虎纹捕鸟蛛雌蛛数量远多于雄蛛数量,为了探究雌、雄蛛粗毒的差异,用不同方法比较了单个虎纹捕鸟蛛雌、雄蛛粗毒的特征.雌蛛单次螫毒量为(26.5±2.47)μL,冻干后粗毒质量为(5.01±0.78)mg,明显高于雄蛛单次螫毒量(10.83±1.35)μL,冻干后粗毒质量(2.05±0.17)mg;用Lowry法和Bradford法测定雌蛛和雄蛛粗毒的蛋白质含量,两种方法均表明雄蛛粗毒中蛋白含量高于雌蛛.用反相高效液相色谱分离雌蛛和雄蛛粗毒蛋白,并215 nm检测色谱图,发现大部分洗脱峰重叠,而雄蛛色谱图中多两个主峰.Tricine SDS-PAGE电泳分析表明雌蛛粗毒相对分子质量小于10 kD的蛋白质含量较高;而Tris SDS-PAGE电泳分析表明雌蛛粗毒相对分子质量大于10 kD的蛋白质含量较低,基于雌蛛和雄蛛粗毒蛋白含量的差异,有必要对虎纹捕鸟蛛雌、雄蛛粗毒进行独立研究.