DNA复制蛋白与复制体

有许多DNA复制蛋白是装配成一定的结构发挥作用,如引物体和复制体。在复制叉处,由DNA pol Ⅲ全酶二体、引物体和解螺旋酶装配成复制体,负责先行链和后行链的同时合成。复制中,后行链模板绕DNA pol Ⅲ全酶形成折迴环,随着复制体在复制叉处前移,后行链以5′→3′的方向合成冈崎片段。     

蛋白质起始的DNA病毒复制机制

DNA聚合酶在DNA合成过程中需要的引物包括RNA引物、DNA自我引物和蛋白质引物3种类型。新DNA链(如冈崎片段)的复制多是在DNA模板上合成一段RNA引物,细小病毒利用其基因组末端的反向末端重复序列(ITRs)自我折叠成DNA引物,而一些DNA、RNA病毒及真菌质粒起始复制反应的引物则是蛋白质。以感染原核生物的噬菌体Phi29和真核DNA病毒腺病毒为例,从复制过程所涉及的蛋白质、对复制原点的识别、复制起始反应、新链的延伸、复制终止过程等方面详细阐述DNA病毒由蛋白质引发的复制机制,并对已商品化的Phi29 DNA聚合酶产品多重置换扩增及单细胞测序等的应用以及基于噬菌体Phi29蛋白质起始的最小复制系统体外扩增异源DNA等最新的应用研究作相关总结介绍。     

DNA引发酶及其在肿瘤增殖和治疗中的作用

DNA聚合酶不能从游离的核苷酸开始合成DNA链,由DNA引发酶合成约7～10个核苷酸的RNA引物．DNA聚合酶利用引物提供自由的3′-OH末端合成新的DNA链。DNA引发酶在DNA复制的起始中起重要作用,而DNA复制是肿瘤细胞增殖的关键,抑制DNA引发酶活性,使引物的合成或延长受阻．DNA复制受抑制,肿瘤细胞不能增殖,从而达到抗肿瘤的目的。因此DNA引发酶是抗肿瘤药物研究的一个理想靶点。     

一种DNA扩增的新技术： 利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应

Bst DNA聚合酶具有热稳定性、链置换活性及聚合酶活性,在体外DNA等温扩增反应中起重要作用. 本文利用Bst DNA聚合酶的5′→3′聚合酶、核苷酸（末端）转移酶及链置换酶活性发展了一种新的体外环式DNA扩增技术跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)．在SRCA反应中,Bst DNA聚合酶以上游引物P1为模板合成其互补链RcP1,并和P1形成双链DNA|之后,Bst DNA聚合酶用其核苷酸转移酶活性在其P1的3′末端沿5′→3′方向随机掺入脱氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸（dNMP)m序列,即DNA的合成反应跨越了RcP1 与下游引物P2之间的缺口|然后,以下游引物P2为模板形成互补序列（RcP2）;接着,Bst DNA聚合酶继续将脱氧核糖核苷酸随机添加到RcP2的3′末端,形成（dNMP)n序列．继而,Bst DNA聚合酶以RcP1为模板,继续催化聚合反应合成互补新链,并通过其链置换酶活性替换P1|如此往复,形成［P1-(dNMP)m-RcP2-(dNMP)n …］序列．本文通过电泳、酶切、测序等方法对扩增产物进行分析,演绎出上述扩增过程,并就工作原理进行了讨论．该反应可能对开发等温扩增技术检测微生物有一定助益,也为解释环介导等温扩增技术中假阳性反应和滚环等温扩增反应中的背景信号提供了线索．     

DNA复制的准确性

本文概述了促成原核生物DNA复制准确性的因素。这些因素主要包括四种脱氧核苷三磷酸的平衡供应、DNA聚合酶反应本身的准确性、DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性的校对功能、需要RNA引物、后随链的不连续合成的机制以及复制后的修复等。     

应用PCR技术定向引入DNA小片段的策略

描述一种应用PCR技术定向引入DNA小片段和特异酶切位点的方法。为了获得m2/loxp66EGFPloxp71基因片段。根据EGFP基因序列,设计一对特异引物,上、下游引物分别引入m2/loxp66、loxp71序列和Xhol、Mlu1酶切位点。以pEGFPN1质粒为模板,采用PCR扩增以合成DNA双链,插入到克隆载体pMD18T。对重组子测序结果表明,实现了DNA小片段和酶切位点的定向引入。     

通过PCR进行长片段DNA的合成

利用PCR合成DNA长片段(Synthesis Large Frament DNA using PCR,SLFD PCR)是一种有效的合成长片段DNA的方法。采用一段已知的500～600bp碱基的DNA片段为PCR模板,根据所要合成的DNA序列可以设计一系列的PCR引物,这些引物都位于模板DNA的5’端,长度为50～60bp,且从5’到3’方向顺序重叠,重叠碱基数目为12～15,全部引物叠加所得到的DNA正是自己所要合成的DNA。这组引物中最3’端的一条含有一个BamH Ⅰ酶切位点,在该位点后面有15碱基与模板DNA5’端一致的序列。另外还设计一条与该模板匹配的下游引物,引物内也含有一个BamH Ⅰ酶切位点。首先采用5’端最右侧的引物与下游引物进行PCR,在PCR进行10个循环后,以此次PCR的产物为下一轮PCR的模板,该轮PCR采用右侧倒数第二个引物为上游引物,下游引物保持不变。采用类似的方法,完成所有的PCR循环,就可以得到所需要合成的DNA长片段。该方法尤其适合100～200碱基左右的长片段DNA的快速合成与克隆。     

人细胞端粒DNA复制与长度维持

端粒位于染色体末端,由短的串联重复DNA片段及其结合蛋白组成。端粒在维持基因组稳定性及染色体结构完整性方面发挥着重要作用。端粒DNA由富含G/C的序列构成,包括双链区及G含量高的3'悬垂单链区(G-overhang,G-tail)。端粒DNA能够形成G四联体(G-quadruplex)和T环(T-loop)等高级结构。许多与DNA损伤修复相关的蛋白质参与端粒DNA的复制与端粒结构的维持,并相对于基因组的其他区域,端粒的DNA复制较为特别,从广义上讲,端粒DNA的复制可以包括双链复制(telomere replication),端粒酶复制延伸(telomerase extension)和C链补齐(C-rich fill-in)。端粒双链复制引起的端粒长度缩短是导致人体细胞衰老的重要原因,而端粒酶复制延伸及C链补齐是干细胞及肿瘤细胞维持其端粒长度及持续分裂能力的主要途径。端粒复制及其结构功能研究是生物医学领域的一个重要热点,阐释端粒复制的机理将为疾病预防及治疗等提供新的思路。     

DNA复制研究步入单分子时代

DNA复制是生命体内必不可少的基本过程之一。传统研究显示DNA复制体中前导链和后随链的合成速度总体来说是一致的,从而避免在新生链中产生明显的单链缺口。主流的观点认为这是由于负责前导链和后随链的两个DNA聚合酶分子之间存在着某种协调同步机制。然而,Kowalczykowski实验室最近采用单分子荧光显微技术实时跟踪发现,大肠杆菌DNA复制体前导链和后随链上两个DNA聚合酶分子互相独立工作,并且都不是匀速行进而是呈现断断续续、时快时慢的随机动态变化。当DNA聚合酶暂停复制时,解旋酶仍会持续解链,导致解旋酶和聚合酶短暂的分离。有意思的是,此时DNA复制体触发一种类似“死人键”(dead-man’s switch)的保险机制,使DNA解旋的速度降低80%,从而恢复解旋酶和聚合酶的偶联。基于单分子水平的实时观察,他们认为前导链和后随链DNA复制进程均遵循一个符合高斯分布的随机模型。这与传统的生化研究观察到两者的合成速度总体来说是一致的并不矛盾。Kowalczykowski实验室的研究实现了从复制开始到结束整个过程对每个单分子行为的连续观测,而传统研究反映的则是经过较长时间对多分子群体平均水平的最终结果进行测定。因此,单分子技术可以极大地弥补传统生化研究的不足。随着未来单分子技术的进步和更广泛的应用,必将把包括DNA复制在内的生物学研究带到一个新的时代。     

DNA连接酶的结构与功能

在ＤＮＡ合成中 ,合成方向为 5′→ 3′ ,即一条链上是连续复制的 ,而另一条链的复制是不连续的 ,必须先合成岗崎片段 (真核细胞的岗崎片段为 10 0ｂｐ ,原核细胞的为 10 0 0ｂｐ)。ＤＮＡ连接酶的作用就是催化岗崎片段的连接以完成ＤＮＡ的合成。另外 ,ＤＮＡ连接酶在ＤＮＡ修复过程中也起重要作用 ,如在切除修复中 ,切除损伤的ＤＮＡ片段 ,以未受损伤的链作为模板合成一条新的ＤＮＡ链后 ,ＤＮＡ连接酶将新合成的ＤＮＡ链与原来的ＤＮＡ链之间的缺口封闭完成ＤＮＡ的修复。ＤＮＡ链未封闭的缺口对细胞具有潜在的危险性 ,所以 ,ＤＮＡ连接…     

酿酒酵母DNA复制的精确时空控制

DNA复制是最基本的生命活动之一。DNA复制本身的错误及其过程控制的异常是细胞内基因组不稳定的主要来源,会导致细胞生长异常、衰老、癌变乃至死亡。为了保证基因组DNA能够精确且完整的复制,DNA复制受到严格的调控。在G1期,DNA复制解旋酶的核心组分Mcm2-7复合体被招募到复制起点,获得复制许可资格。进入S期后,在两个周期性蛋白激酶及多个支架蛋白的作用下,复制解旋酶的激活因子Cdc45和GINS复合体被招募至Mcm2-7,形成解旋酶全酶Cdc45-Mcm2-7-GINS (CMG)复合体。随后,众多复制相关蛋白在精准的时空控制下被招募至CMG平台并组装成复制机器,起始DNA双向复制。当相向而行的两个复制叉相遇,复制机器会从DNA链上解离下来,从而完成DNA复制。关于DNA复制过程的研究在近十年来取得了跨越式的突破。本文以酿酒酵母为例,围绕所有真核生物中都高度保守的DNA复制控制开关——CMG解旋酶,对真核生物DNA复制的最新进展进行综述。     

真核细胞DNA复制叉稳定性维持机制的研究进展

DNA复制是细胞最基本的生命活动之一,是生物体生存和繁殖的基础。从原核生物到真核生物,DNA复制过程基本保守,分为复制起始和延伸两个阶段。复制叉是DNA复制的基本结构,它容易遭受多种内源或外源的DNA复制压力影响而停顿,导致基因组不稳定,引起细胞凋亡、癌变或细胞死亡等严重后果。为了维持复制叉的稳定,细胞进化出了一系列机制,其中最重要机制之一便是S期细胞周期检验点。就影响DNA复制叉稳定的内外因素、S期细胞周期检验点与复制叉稳定性的关系以及复制叉稳定性与相关疾病的发生、治疗等问题进行简要综述。     

DNA只有一条链能被转录吗

1981年,Tomizawa(美)首先发现在细菌Escherichiacoli体内的有义DNA(即以前认为不具有转录能力的DNA链)可转录形成一种不翻译表达的反义RNA对质粒(细菌体内一种小的DNA双链环)的复制进行调控。因为质粒的复制需要以一种特殊的RNA作为引物(详细的机理可参阅《生物学通报》1990,4《关于DNA复制的引物和DNA聚合酶》一文)而根据碱基互补原则,对应的反应RNA显然可以与它互补结合,从而使它丧失作为引物的能力。这样,细菌就可以通过对反义RNA转录数量的控制,达到调控质粒复制的目的。在随后短短的几年中,研究人员不断在病毒和细菌     

细菌中RNase HI介导RNA降解的研究进展

在细菌细胞中,为了维持基因组稳定和正常的生命活动,RNase HI通常以降解RNA/DNA杂合链中RNA的方式来防止复制中引物的积累以及转录中R环的形成。RNase HI对底物的识别主要依赖于DNA与RNA结合槽,对底物的催化主要依赖于DEDD基序和位于活性位点附近柔性环中的一个组氨酸。以Mg²⁺为代表的金属离子在催化过程中发挥了至关重要的作用。杂交双链中ssDNA突出部分的类型决定了RNase HI的作用模式：在没有突出或在ssDNA的5′端存在突出部分的情况下,RNase HI作为一种非序列特异性核酸内切酶随机地降解RNA;当ssDNA的3′端存在突出部分时,RNase HI依靠5′核酸外切酶活性对RNA进行连续切割。RNase HI、Rep、DinG和UvrD通过与单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein, SSB)的C端尾部的6个残基相互作用被招募到复制叉附近,并可能以协作的方式解决复制-转录冲突。RNaseHI的缺失或活性降低将引起DNA结构不稳定、基因突变、转录装置回溯和复制不协调等一系列有害后果。RN...     

双链DNA模板循环测序的研究

采用末端标记引物进行双链ＤＮＡ循环测序是实验室快速,准确获得双链ＤＮＡ模板序列的有效方法。实验结果表明：该测序法不仅能消除由于模板不纯所导致的引物的非特异性结合等因素而产生的非特异条带,而且能降低ＰＣＲ产物测序的背景问题。     

DNA聚合酶Ⅰ

1957年科恩伯格(A.Kornbeng)通过测定放射性标记的[~(14)C]胸苷三磷酸参入DNA的能力,发现一种催化DNA合成的酶。这种酶现在叫做DNA聚合酶Ⅰ或Pol Ⅰ,为含有928个氨基酸残基的多肽单链。酶促反应的底物是4种脱氧核苷三磷酸。反应需要DNA模板和一小段与模板互补的多核苷酸引物。反应中,引物或生长中DNA链的3′羟基与新参入核苷酸的α-磷酸基结合。反应     

细胞DNA辐射损伤的修复

遗传复制是生物的基本特征之一。分子生物学的发展已经证实,遗传复制的物质基础是具有双链对应结构的DNA大分子。DNA的自我复制和作为RNA模板的功能的重要性,已经为人们所认识。近十年来对DNA修复机制的阐明,使人们可以由复制、模板和修复三种主     

R环的形成及对基因组稳定性的影响

R-环是由一个RNA:DNA杂交体和一条单链状态的DNA分子共同组成的三链核酸结构。其中, RNA:DNA杂交体的形成起因于基因转录所合成的RNA分子不能与模板分开, 或RNA分子重新与一段双链DNA分子中的一条链杂交。在基因转录过程中, 当转录泡遇到富含G碱基的非模板链区或位于某些与人类疾病有关的三核苷酸卫星DNA时, 转录泡后方累积的负超螺旋可促进R环形成。同时, 新生RNA分子未被及时加工、成熟或未被快速转运到细胞质等因素也会催生R环。研究表明, 细胞拥有多种管理R环的方法, 可以有效地管理R环的形成和处理已经形成的R环, 以尽量避免R环对DNA复制、基因突变和同源重组产生不利影响。文章重点分析了R-环的形成机制及R环对DNA复制、基因突变和同源重组的影响, 并针对R-环诱导的DNA复制在某些三核苷酸重复扩增有关的神经肌肉退行性疾病发生过程中的作用进行了分析和讨论。     

编码酵母丙氨酸tRNA两个半分子的DNA的克隆

用DNA合成仪合成寡聚脱氧核苷酸。用T4-DNA连接酶把这些寡聚脱氧核苷酸重组成双链DNA。这两个双链DNA的上游是T7-启动子,下游分别编码酵母丙氨酸tRNA的5′半分子(1-35位核苷酸)和3′半分子(35-76位核苷酸)。再把这两个双链DNA克隆到PUC 12质粒中。经点杂交筛选和DNA顺序测定证明克隆是成功的。     

特异性DNA倍增技术(PCR)及其应用

特异性DNA倍增技术(PCR)是近年来发展的一种新技术,具有快速、简便、灵敏、特异性高和重复性好等优点,尤其适合于临床分子生物学检测。PCR技术包括三个循环过程:(1)模板DNA的变性,(2)模板DNA-引物的复性,(3)DNA聚合酶作用下的引物链的延伸。本文对耐高温Taq DNA聚合酶、PCR的反应体系、PCR产物特异性的影响因素和PCR技术的应用等几个方面进行了综述。