空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立

本研究使用恒温环介导技术, 以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物, 建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性, 其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明, 设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较, 结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度, 比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明, 结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤, 可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。     

空肠弯曲菌的磁捕获_-荧光PCR检测方法的建立

为提高畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度,应用抗血清和磁性微珠首次制备弯曲菌免疫磁珠,利用弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中目的菌,不需要增菌培养;通过荧光PCR检测鞭毛蛋白A(flaA)基因和/或马尿酸酶(hipO)基因,首次建立空肠弯曲菌的磁捕获-荧光聚合酶链反应(IMC-FPCR)方法.IMC-FPCR法检测空肠弯曲菌方法简便易行,可在24h内完成,特异性好,检测低限达到10cfu/mL,抗干扰性强.IMC-FPCR方法可望解决非可培养状态的空肠弯曲菌检测难题,是一种适用于检验检疫、卫生防疫和农产品安全检验等领域的快速方法.     

基于单碱基延伸标签反应的常见食源性致病菌基因芯片检测方法的建立

针对8种常见的食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌),建立了基于单碱基延伸标签反应原理的基因芯片检测方法。筛选和整合8种食源性致病菌基因组中的特异性序列和相应PCR引物,致病菌靶DNA片段被扩增和纯化作为单碱基延伸标签反应的模板,反应产物在DNA芯片上与探针进行杂交反应,然后通过扫描基片的荧光强度进行判断。实验结果表明,可采用基于单碱基延伸标签反应的基因芯片方法同时特异性检测8种食源性致病菌,基因组DNA多重检测灵敏度可达到0.1pg,以鼠伤寒沙门氏菌为单一检测对象的细菌纯培养物灵敏度可达到5×102CFU/mL。本方法可以快速灵敏地检测食源性致病菌,为食源性疾病的诊断和防治提供了一个有效的方法。     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

空肠弯曲菌的磁捕获_-荧光PCR检测方法的建立

为提高畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度 ,应用抗血清和磁性微珠首次制备弯曲菌免疫磁珠 ,利用弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中目的菌 ,不需要增菌培养 ;通过荧光PCR检测鞭毛蛋白A(flaA)基因和 或马尿酸酶 (hipO)基因 ,首次建立空肠弯曲菌的磁捕获_荧光聚合酶链反应 (IMC_FPCR)方法。IMC_FPCR法检测空肠弯曲菌方法简便易行 ,可在 2 4h内完成 ,特异性好 ,检测低限达到 10cfu mL ,抗干扰性强。IMC_FPCR方法可望解决非可培养状态的空肠弯曲菌检测难题 ,是一种适用于检验检疫、卫生防疫和农产品安全检验等领域的快速方法。     

139株空肠弯曲菌耐药性分析

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是最常见的食源性病原菌之一。本研究采用微量肉汤稀释法对分离得到的139株空肠弯曲菌(117株为禽源样本分离株,22株为人源样本分离株)进行耐药性检测。通过对最小抑菌浓度(MIC)的判定结果得出:120株(86. 33%)空肠弯曲菌分离株对6类9组临床常用的抗生素表现出不同程度的耐药,其中禽源空肠弯曲菌耐药率为83. 76%,22株人源空肠弯曲菌均表现出耐药性。对喹诺酮类抗生素表现出高度耐药(环丙沙星80. 58%,萘啶酸77. 70%);对四环素类表现为中等耐药(四环素53. 24%);对部分大环内酯类、氨基糖苷类、林可酰胺类表现为低耐药(庆大霉素7. 19%,阿奇霉素5. 76%,克林霉素6. 47%);对酰胺醇类、部分大环内酯类表现为敏感(氟苯尼考0%,红霉素0%、泰利霉素0%)。139株空肠弯曲菌共产生14种耐药谱型,以TET-CIP-NAL谱型最多,占比38. 13%,耐三重及以上抗生素的多重耐药菌株占比53. 24%。禽源菌株中多重耐药占比46. 15%,人源菌株中多重耐药占比90. 91%。研究结果显示空肠弯曲菌耐药现状不容乐观,尤其对喹诺酮类与四环素类抗生素耐药性较为突出,且过半数菌株为多重耐药。本研究为食源性空肠弯曲菌的防控及临床用药提供参考。     

基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立

建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法, 为3种食源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵敏的方法。分别选取编码志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、沙门氏菌肠毒素(stn)基因和致泻性大肠杆菌O157志贺样毒素(slt)基因设计引物和探针, 进行三重PCR扩增, 产物与含特异性探针的芯片杂交。对7种细菌共26株菌进行芯片检测, 仅3种菌得到阳性扩增结果, 证明此方法具有很高的特异性。3种致病菌基因组DNA和细菌纯培养物的检测灵敏度约为8 pg。对模拟食品样品进行直接检测, 结果与常规细菌学培养结果一致, 检测限为50 CFU/mL。结果表明：所建立的基因芯片检测方法特异性好, 灵敏度高, 为食源性致病菌的检测提供了理想手段, 有良好的应用前景。     

番茄环斑病毒纳米荧光颗粒试纸条的研制

目的:研发一种快速、便捷检测番茄环斑病毒(ToRSV)的方法。方法:以荧光纳米颗粒为标记物,采用免疫层析试验方法制备ToRSV荧光纳米颗粒试纸条,在紫外灯下观察试纸条上的荧光信号,作为结果判定依据。结果:用制备的荧光纳米颗粒试纸条检测包括ToRSV在内的9种病毒,仅ToRSV有阳性反应,其余待测样品均呈阴性,表明该试纸条具有较好的特异性;用该荧光试纸条与传统胶体金试纸条进行灵敏度测试时,其灵敏性高于胶体金试纸条1倍以上,且稳定性试验结果良好。结论:ToRSV荧光纳米颗粒试纸条的研制,为快速检测ToRSV提供了有效手段,该方法可用于现场检验,具有广阔的应用前景。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA

目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法。方法：利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5＇端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价。最后收集15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果：试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250copies/mL。在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。结论：核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测 HBV DNA

目的:本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法.方法:利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5'端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素.核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体.将扩增产物与展开液混合后点样,10min 后即可用肉眼判读结果.在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价.最后收集15例阴性样本及33例HBsAg 阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较.结果:试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250eopies/mL.在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%.且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异.结论:核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用.     

三种重要水果褐腐病菌快速检测试纸的研制

以水果上3种重要的褐腐病菌,即美澳型核果褐腐菌(Monilinia fructicola)、核果褐腐菌(M. laxa)和仁果褐腐菌(M.fructigena)为检测对象,研究开发适用于口岸水果检疫的快速检测试纸。以硝酸纤维素膜为固相载体,以病菌翻译延长因子基因(Translation elongation factor 1-alpha,EF-1α)为检测靶标,生物素标记的PCR扩增产物为检测标记物,采用DNA-DNA杂交方式对3种褐腐病菌进行试纸法快速检测。分别以褐腐病菌DNA和本研究构建的EF-1α重组质粒DNA为阳性标准品检验试纸的特异性和灵敏度。试验结果表明,本研究开发的检测试纸能够同时特异地检出以上3种褐腐病菌,整个检测流程(包括DNA提取和扩增过程)在2 h内即可完成,最低检测限达到10 fg/μL。其特异性强、灵敏度高、稳定性好,且检测结果可肉眼判定,无需依赖昂贵设备,便于向基层检疫实验室推广使用。     

安徽部分地区动物源弯曲菌的分离鉴定及多位点序列分型

【背景】弯曲菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,革兰氏阴性、微需氧、弯曲螺旋状。【目的】为了解安徽地区弯曲菌流行状况和分子遗传特征,对安徽6个不同地区动物源的弯曲菌进行分离鉴定,并研究分离株分子分型。【方法】通过形态学及培养特性观察、生化试验、PCR方法对菌株进行鉴定。以弯曲菌7个管家基因asp A、gln A、glt A、gly A、pgm、tkt和unc A为目的基因对分离株进行多位点序列分型,并制成遗传进化树。【结果】共分离到42株弯曲菌菌株,源自6个地区的分离株具有较为一致的形态特性和相似的生化特性。多位点序列分型结果显示,本研究中共获得32种ST型,共发现9种新的ST型(8190、8222、8223、8831、8833、8841、8832、8834和8843)和6个新的等位基因(gln A606、gln A607、glt A518、gly A680、pgm863和unc A541)。进化树结果显示,空肠弯曲菌与结肠弯曲菌遗传关系相差甚远,聚集归为两个大群,分别有5个分支和3个分支。【结论】安徽6个地区不同来源的空肠弯曲菌与结肠弯曲菌均有丰富的基因型,且没有明显优势的基因型。从遗传变异的角度来看,空肠弯曲菌复杂多样,结肠弯曲菌相对保守。     

鞭毛介导的空肠弯曲菌氧应激机制研究进展

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是世界范围流行的食源性人兽共患病原菌,是革兰氏阴性微需氧菌。其对氧气、温度、pH和胆汁酸盐等环境条件极其敏感,在环境传播和宿主定殖过程中会遭受许多不利条件,包括致命的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),因此,抵抗活性氧自由基是空肠弯曲菌进化的一种重要策略。空肠弯曲菌为抵抗氧应激进化出了多种响应机制,其中,鞭毛及其介导的运动力也参与氧应激。本文对国内外有关空肠弯曲菌氧应激研究进展及鞭毛介导的氧应激机制进行综合阐述,以期为进一步完善空肠弯曲菌氧应激调控系统奠定基础,并为弯曲菌源头防控提供思路。     

空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素B蛋白(CdtB),制备其单克隆抗体(mAb),并研究mAb抗毒性作用。【方法】扩增空肠弯曲菌cdtB基因并将其构建到pET-30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,以原核表达的GST-CdtB蛋白为免疫原,应用杂交瘤技术进行细胞融合;采用间接ELISA方法测定细胞上清和mAb腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析mAb特异性,并以CaCo-2和HD-11细胞为模型,鉴定mAb抗毒性能力。【结果】成功构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-cdtB和pGEX-6p-1-cdtB,并融合表达rHis-CdtB和rGST-CdtB蛋白。获得5株稳定分泌CdtB抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F3,1F5,2E4,2E11,2F2。抗体Ig类和亚类检测显示2E11 Ig亚类为IgG2b,其他4株均为IgG1。抗体效价高达1:(1×108)。Dot-ELISA试验表明5株mAb均能与空肠弯曲菌标准株发生特异性反应,与非空肠弯曲菌呈阴性反应;Western blot法分析表明5株mAb均能与纯化蛋白rGST-CdtB有良好的反应性。基于CaCo-2细胞的黏附和侵袭实验表明mAb能显著降低细菌的黏附和侵袭能力(P0.01)。【结论】成功制备了针对空肠弯曲菌CdtB蛋白的mAb。为进一步研究空肠弯曲菌致病机制,以及为研制治疗性类药物奠定了基础。     

空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的研究进展

多数细菌都存在发挥免疫防御机制作用的CRISPR/Cas系统,在不同种属间呈现多态性。空肠弯曲菌是全球范围内重要的食源性病原菌,所致疾病也是典型的自限性疾病,其复杂的致病机制并未得到明确的解析,而空肠弯曲菌CRISPR/Cas系统的结构呈现多态性,研究两者关系仍存在诸多限制。本文从CRISPR/Cas系统在空肠弯曲菌中的结构、机制及技术应用等方面的研究进展进行综述,为探索空肠弯曲菌致病机制提供新思路。     

软骨寡聚基质蛋白荧光免疫层析定量检测方法建立

本研究旨在建立一种可用于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)辅助诊断的人软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)荧光层析检测方法。采用双抗体夹心法原理制备免疫层析试纸条,并进行性能评价及方法学对比。通过对临床样本的检测得到受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线,计算试纸条灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。线性范围为0.39–50.00ng/mL;批内批间变异系数均小于15%;试纸条37℃加速破坏20d,荧光信号强度变化范围在15%以内;与类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗环瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide,anti-CCP)抗体无交叉反应;与ELISA试剂盒平行检测48份临床血清样本,相关性良好。采用本研究制备的试纸条检测样本,COMP区分RA患者和健康人的cut-off值为22.55 ng/mL (灵敏度为0.821,特异度为0.842,阳性预测值为0.741,阴性预...     

2010 年上海市食源性沙门菌菌型分布和药敏分析 以及快速检测方法的建立

目的:通过对2010年上海市市售食品中食源性沙门菌污染状况、菌型分布及药敏试验进行分析,初步确定该地区食源性沙门菌的菌型分布及耐药性,为防治因沙门菌感染引起的食源性疾病提供科学依据,并摸索建立了针对沙门菌的快速检测方法。方法:对农贸市场和超市的5类840份市售食品进行沙门菌分离鉴定及耐药性分析,并根据沙门菌的侵袭蛋白A(invA)基因序列设计保守引物,特异性快速检测沙门菌。结果:本次市售食品沙门菌阳性率检出率为4.29%,共36株沙门菌,生禽畜肉所占比例高达91%。主要血型为鼠伤寒沙门菌,德尔卑沙门菌和都柏林沙门菌。36株沙门菌药敏分析显示:所有菌株对头孢类等抗生素敏感较高,但对氨苄西林、麦迪霉素、环丙沙辛、呋喃妥因等存在普遍较多耐药菌株,并在此基础上通过PCR法成功地特异性检测出沙门菌。结论:上海市市售食品沙门菌污染以生禽畜肉为主,对抗菌药物的耐药性较高。目前治疗市售食品中食源性沙门菌引起的食源性疾病应首选头孢内等抗生素。另外PCR快速检测方法也操作简单,特异性强,灵敏度高,对食品中沙门菌污染能起到快速检测和监控。     

多酶恒温扩增核酸试纸条法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

【背景】肺炎支原体是导致儿童和青少年呼吸道感染的重要病原体,长期以来由于其临床表现不特异而容易错过最佳治疗时期。【目的】结合多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)技术和核酸试纸条建立一种快速检测肺炎支原体的方法。【方法】以肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征(community acquired respiratory distress syndrome, CARDS)毒素编码基因为靶基因设计引物和探针,对反应体系的温度、时间等进行优化,评估其敏感性,通过检测肺炎支原体和其余7种病原体分析其特异性,并对35份临床样本进行验证。【结果】MIRA核酸试纸条法在37℃条件下,15 min内便可完成对肺炎支原体的检测,最低检出限为10 copies/μL;除肺炎支原体外,其余7种病原体均不能扩增,特异性较好。以实时荧光PCR检测为标准,MIRA核酸试纸条法对35份临床样本检测后的诊断特异度为100.00%、灵敏度为96.15%、阴性预测值为90.00%、阳性预测值为100.00%。【结论】本研究建立了MIRA核酸试纸条法...     

基于滚环扩增技术的纸基显色传感器用于致病菌快速检测

近年来,食源性致病菌在全球范围内大面积传播,给人类的生存健康与发展带来了巨大的威胁。因此为了保证食品的安全,快速的、高特异性且高灵敏地检测食品致病菌方法已经成为科学研究的热点话题。在本研究中,我们构建了一种基于滚环扩增技术的纸基显色传感器用于可视化检测致病菌的检测平台。通过滚环扩增对单增李斯特菌的hly A mRNA进行高效特异性扩增,扩增后的单链产物经过Hhal酶进行特异位点酶切后,形成与锁式探针长度相同的片段。将酶切后的单链产物不经过预变性杂交,可直接进行试纸条检测。在优化的实验条件下,可以检测到100 pg/μL总RNA。整个过程实验包括连接,扩增,酶切,检测等反应均可在恒温条件下进行,且可在几个小时内完成。这种方法适用于快速的现场检测,此外,这项研究强调了纸基显色诊断平台的潜在价值和应用前景。     

Asia1型口蹄疫病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏检测Asia1型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析方法(GICA)。本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体,将该标记物与羊抗豚鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membrane)上,作为检测带和质控带。经条件优化,组装成检测Asia1型口蹄疫的诊断试纸条。用该试纸条分别对A、O、C和Asia1型口蹄疫病毒抗原以及猪水泡病病毒抗原等87份样品进行了检测,发现该试纸条不与口蹄疫病毒A、O、C型以及猪水泡病病毒抗原发生反应,特异性良好。用该试纸条对口蹄疫细胞毒(TCID50为6.25)的10倍系列稀释液进行了检测,最低可以检测到大约10?4。该试纸条与其他传统诊断方法的符合率为98.8%。初步实验确定该试纸条在4oC下可保存3个月、37oC和室温下大概可保存1周左右。该试纸条是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对现场检测具有一定实用价值。