空肠弯曲菌的磁捕获_-荧光PCR检测方法的建立

为提高畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度,应用抗血清和磁性微珠首次制备弯曲菌免疫磁珠,利用弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中目的菌,不需要增菌培养;通过荧光PCR检测鞭毛蛋白A(flaA)基因和/或马尿酸酶(hipO)基因,首次建立空肠弯曲菌的磁捕获-荧光聚合酶链反应(IMC-FPCR)方法.IMC-FPCR法检测空肠弯曲菌方法简便易行,可在24h内完成,特异性好,检测低限达到10cfu/mL,抗干扰性强.IMC-FPCR方法可望解决非可培养状态的空肠弯曲菌检测难题,是一种适用于检验检疫、卫生防疫和农产品安全检验等领域的快速方法.     

基于全基因组序列的弯曲菌特征分析

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和结肠弯曲菌(Campylobacter coli)是引起人类腹泻的主要致病菌。传统生化方法在鉴定弯曲菌时存在步骤多、耗时长、通量低等问题。本研究通过利用生物信息学方法对弯曲菌全基因组进行序列、基因注释、耐药基因、多位点序列分型以及CRISPR-Cas系统等分析,挖掘能够有效区分空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的高分辨力特征。实验结果表明,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌在基因组序列长度、GC含量、基因数量、多位点序列分型以及CRISPR-Cas系统等方面存在显著差异。同时,研究还发现了一段在空肠弯曲菌基因组中广泛存在的高分辨力CRISPR重复序列。这些特征可用于构建能够准确鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的生物信息学方法。     

基于PCR-免疫试纸条法的空肠弯曲菌快速检测

空肠弯曲菌引起的食源性腹泻疾病已经成为突出的公共卫生问题之一，快速检测食品中空肠弯曲菌污染对于保障人类健康具有重要意义。本研究以空肠弯曲菌lpxA基因序列为检测靶基因，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增产物上标记的地高辛和异硫氰酸盐(isothiocyanate,ITC)分子与试纸条上抗体特异性结合，建立了一种PCR-试纸条检测方法。所有空肠弯曲菌标准菌株均为阳性结果，其他弯曲菌以及食源性病原菌均为阴性结果，检测特异性为100%；最低检出限为3.1×10³CFU/mL；在对食品的实际检测中，该方法与现有国标检测方法结果一致。将本方法用于空肠弯曲菌的检测降低了成本，简化了操作步骤，为食源性空肠弯曲菌检测提供了一种实用、简便的手段。     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

中国小型猪空肠弯曲菌的首次分离及其鉴定

目的对中国小型猪空肠弯曲菌进行分离鉴定。方法采集发病小型猪标本,采用细菌学分离培养、生化鉴定、药敏试验、血清学试验、PCR检测等方法进行鉴定,并对细菌的分子生物学特征进行分析。结果分离到1株细菌,经鉴定为空肠弯曲菌（CJp0812）。用空肠弯曲菌flaA基因特异引物对CJp0812细菌的PCR扩增为阳性,经核苷酸序列测定分析证实上述序列与空肠弯曲菌NCTC11168基因序列（GenBank登录号：NC002163）同源性高达99%。结论首次从中国小型猪中分离到了空肠弯曲菌,为进一步研究该菌及开展流行病学调查提供了科学依据。     

表达空肠弯曲菌CfrA蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果北大核心CSCD

【目的】本试验将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统,然后将重组乳酸乳球菌口服免疫鸡,降低空肠弯曲菌在鸡肠道中的定殖。【方法】利用PCR分别扩增空肠弯曲菌cfrA全基因及其N端片段,插入食品级表达载体pNZ8149多克隆位点并转化乳酸乳球菌NZ3900,通过Western blot鉴定重组菌株CfrA蛋白表达情况,同时通过筛选nisin浓度、温度、时间等诱导条件优化重组蛋白表达水平;进而将重组乳酸乳球菌经口服免疫SPF鸡,免疫后分别测定乳酸乳球菌自鸡体内的排出情况、以及诱导CfrA血清抗体和粘膜抗体水平,最后将空肠弯曲菌口服攻毒免疫后的鸡,通过测定鸡泄殖腔棉拭子中空肠弯曲菌的数目来判定口服免疫效果。【结果】Western blot检测显示CfrA全基因及其N端片段均可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达,不分泌,筛选的最佳诱导表达条件为nisin浓度25 ng/mL、温度37°C、时间1 h。口服乳酸乳球菌10 d内自鸡体完全排空;鸡口服免疫后可产生CfrA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体;重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。【结论】成功构建了重组CfrA蛋白的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统;表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用,为研制重组乳酸菌口服家禽免疫制剂防治空肠弯曲菌奠定了基础。     

基于凝集素-糖蛋白特异结合的特性筛选与鉴定空肠弯曲杆菌NCTC11168株糖蛋白

[目的]从空肠弯曲杆菌NCTC11168菌株中筛选糖蛋白.[方法]本实验基于凝集素-糖蛋白特异结合的特性,先用免疫印迹的方法确定空肠弯曲杆菌内糖蛋白能与凝集素SBA特异结合,再用包被有凝集素SBA的磁珠捕获样品中的潜在糖蛋白,通过N-乙酰半乳糖胺竞争性洗脱及双向电泳分离,最后利用串联质谱鉴定捕获的糖蛋白.[结果]质谱分析共鉴定到22种空肠弯曲杆菌蛋白,其中至少5种为已报道糖蛋白,包括Cj0633在内的17种为迄今为止未知的潜在糖蛋白.[结论]这种糖蛋白筛选策略可用于细菌糖蛋白的分离鉴定.     

空肠弯曲菌活而不可培养状态的产毒素能力及毒素基因表达的检测

目的 通过诱导空肠弯曲菌进入活的不可培养(VBNC)状态建立细胞学模型,用VeroE6细胞和HeLa细胞检测空肠弯曲菌产细胞膨胀性肠毒素(cytotoxic distendingtoxin,CDT)能力的改变,并在RNA水平上进一步验证毒素的表达。方法 采用4℃冷藏及-70℃冷冻的方法诱导空肠弯曲菌进入VBNC状态,利用细胞总数计算、活细胞染色计数及可培养细胞计数间接确证VBNC状态细菌的存在,细胞对于VBNC状态下的细菌仍然敏感,并用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实空肠弯曲菌毒素基因的表达。结果 3种不同状态的细胞计数结果表明存活细胞进入了VBNC状态,细菌经4℃冷藏及-70℃冷冻后数量减少约1个数量级,在冷冻前,细菌对细胞毒性较强,72h时70%以上细胞凋亡,冷冻后的VBNC状态细菌对VeroE6和HeLa细胞的生长仍有影响,72h时约有40%细胞进入凋亡状态。结论 低温、贫养条件下空肠弯曲菌可进入VBNC状态,用常规传统的羊血平板培养基仅能使不到10%的空肠弯曲菌复苏生长,从而可以检测,在VBNC状态时,空肠弯曲菌产毒素能力改变较大,远远低于正常状态,但仍具备产毒素的能力,也从RNA水平实验得到证实。     

空肠弯曲菌cheA基因插入突变及其对小鼠空肠定植能力的影响

摘要：【目的】构建空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）cheA基因插入突变株,了解CheA与空肠弯曲菌小鼠体内定植的相关性。【方法】运用同源重组的原理构建空肠弯曲菌cheA基因突变株,采用PCR技术检测cheA突变株的构建情况。通过基因回补试验构建cheA基因回补株。空肠弯曲菌感染小鼠,运用小鼠空肠内容物涂板计数的方法检测cheA突变株、cheA基因回补株和野生株定植小鼠能力的差异。【结果】PCR检测显示成功构建cheA基因突变株。空肠弯曲菌cheA基因突变株定植小鼠空肠的数量明显减少（P<0.05）;cheA基因回补株定植小鼠空肠的数量跟野生株相比无明显差异（P>0.05）。【结论】本研究成功构建cheA基因突变株及其回补株。cheA基因可能参与空肠弯曲菌在小鼠体内定植的过程。     

检测大肠杆菌(Escherichia coli) O157:H7免疫磁珠的制备、保存与应用

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli) O157:H7是导致肠出血性大肠杆菌食源性疾病暴发的主要血清型,免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMBS)在E. coli O157的检测中发挥着重要作用,而免疫磁珠的稳定性、特异性、广谱性等性能指标关系着在实际应用中的使用效果。【目的】制备高效、稳定且具有广谱性的免疫磁珠,联合分子检测技术如环介导恒温扩增 (Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术、PCR等,提高目标菌的检出率。【方法】采用新型的磁珠活化剂MIX&GO制备E. coli O157免疫磁珠,并进行广谱性以及特异性检测;针对6种试剂牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、酪蛋白(Casein)、海藻糖(Trehalose)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone,PVP)、抗坏血酸(Vitamin C)和防腐剂ProClin 300,利用正交试验L18(37)优化免疫磁珠保存液组分;采用IMBS-LAMP、IMBS-PCR、IMBS-生化、菌液-LAMP、菌液-PCR、显色平板-生化鉴定6种方式对20份生猪肉样品进行检测。【结果】利用MIX&GO活化剂制备的免疫磁珠捕获率最高达到81.5%±1.3%;免疫磁珠保存液最优配方为：牛血清白蛋白15.0 g/L,酪蛋白10.0 g/L,海藻糖10.0 g/L,PVP 2.0 g/L,抗坏血酸5.0 g/L,ProClin 300 2.5 g/L,保存6个月后免疫磁珠捕获率为75.5%;在20份生猪肉样品的检测中,自制磁珠和商品化磁珠与LAMP联用均检出9例阳性样品;IMBS-LAMP在6种检测方式中具有最高的检测灵敏度,但检出的样品会因磁珠抗体的差异而有所不同。【结论】与商品化磁珠相比,实验制备的免疫磁珠具有良好的特异性和广谱性,免疫磁珠-LAMP联用提高了目标菌的检出率,是一种高灵敏度、具有应用前景的检测方法。     

空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立

本研究使用恒温环介导技术, 以空肠弯曲菌的促旋酶基因A(gyrA)设计引物, 建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。不同来源的4株空肠弯曲菌LAMP检测均显示阳性, 其他14种细菌LAMP检测显示阴性。实验结果表明, 设计的引物具有良好的特异性。本研究进行了LAMP检测方法与细菌平板计数法和PCR法的灵敏度比较, 结果LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度, 比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。我们还研究发现提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。使用LAMP方法对鸡法氏囊的检测表明, 结合核酸提取步骤中的DNase处理步骤, 可以准确的检测出鸡法氏囊中的空肠弯曲菌。     

空肠弯曲菌生物学特性上的一些歧异

对195例不同年龄腹泻患者的粪便、690只健康和腹泻畜禽的直肠和泄殖腔拭子及108份腹泻死亡畜禽的脏器材料进行了空肠弯曲菌培养,共分离鉴定458株弯曲菌(其中空肠弯曲菌445株、结肠弯曲菌13株),就其一些生物学特性进行了观察,采用Lior生物学分型法进行了354株弯曲菌(空肠弯曲菌352株、结肠弯曲菌2株)的分型。虽然表明绝大多数生物学性状符合已有文献描述,但也发现在形态、培养和生理生化特性及抗菌药抗性上存有一些歧异,其中最为主要的是483%(215/445)的空肠弯曲菌和231%(3/13)的结肠弯曲菌有萘啶酮酸抗性,11%(5/445)的空肠弯曲菌和76%(1/13)的结肠弯曲菌有噻孢霉素抗性,抗菌药抗性与菌株来源有关(P<0005)。352株空肠弯曲菌生物学分型结果表明在这些动物体内生物型Ⅰ(409%)和Ⅱ(582%)占优势,同一动物体内可有该菌的2个生物型分布。     

宿主菌富集空肠弯曲菌噬菌体培养条件的优化

【背景】开发噬菌体产品是一种防控空肠弯曲菌有潜力的策略,但是面临噬菌体分离的挑战。【目的】运用响应面法对宿主菌富集空肠弯曲菌噬菌体的培养条件进行优化。【方法】通过单因素试验分析培养基、培养温度、培养转速、离子添加剂对噬菌体富集效果的影响,以噬菌体回收率为评价指标,采用响应面法优化了空肠弯曲菌噬菌体的富集培养条件。【结果】在37℃条件下进行静置培养时,噬菌体富集培养效果最佳,回收率为354.12%。分离噬菌体的过程包括采样并制备滤液、宿主菌与样品滤液共培养及噬菌体分离与鉴定等环节。应用此方法从鸡粪便中分离空肠弯曲菌噬菌体,与传统的单斑法相比,噬菌体分离率提高了269.23%。【结论】研究优化的宿主菌富集噬菌体培养方法可提高空肠弯曲菌噬菌体的分离效率,为噬菌体的研究提供思路。     

免疫磁珠富集技术联合选择性培养基快速检测单增李斯特菌

单增李斯特菌是一种危害极大的食源性致病菌,建立快速及特异的检测方法对于食品安全监控尤为重要。文中联合免疫磁珠与选择性培养基对不同浓度(101~105CFU/mL)单增李斯特菌进行检测,并对3种李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌进行交叉试验;同时模拟食物污染,探索免疫磁珠-平板法检测样品的检测限以及该方法的最快检测时间。结果显示特异性免疫磁珠联合选择性平板法可检出浓度为103CFU/mL及以上的单增李斯特菌;牛奶样品仅需6 h增菌能被检出,检测限为0.7 CFU/mL。联合使用免疫磁珠富集技术与选择性培养基,能在30 h内完成对牛奶样品的检测,较国标法减少38 h以上,且具有同等的灵敏度。     

多位点序列分型分析空肠弯曲菌华东动物源分离株

【目的】研究空肠弯曲菌菌株间的分子特征,对不同宿主来源的空肠弯曲菌进行分子分型研究。【方法】选择空肠弯曲菌的7个看家基因gltA、aspA、glnA、glyA、pgm、tkt和uncA作为目的基因,对2006-2008年间华东地区分离的42株空肠弯曲菌样本进行PCR扩增后测序。将测序结果软件分析并上传到数据库进行比对,将结果制作多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)遗传进化树并进行分析。【结果】与数据库已有类型比对,发现了24个新的ST型,通过进化树得到其遗传关系。【结论】MLST方法对于研究空肠弯曲菌的菌株群体基因差异与进化趋势具有重要意义。     

安徽部分地区动物源弯曲菌的分离鉴定及多位点序列分型

【背景】弯曲菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,革兰氏阴性、微需氧、弯曲螺旋状。【目的】为了解安徽地区弯曲菌流行状况和分子遗传特征,对安徽6个不同地区动物源的弯曲菌进行分离鉴定,并研究分离株分子分型。【方法】通过形态学及培养特性观察、生化试验、PCR方法对菌株进行鉴定。以弯曲菌7个管家基因asp A、gln A、glt A、gly A、pgm、tkt和unc A为目的基因对分离株进行多位点序列分型,并制成遗传进化树。【结果】共分离到42株弯曲菌菌株,源自6个地区的分离株具有较为一致的形态特性和相似的生化特性。多位点序列分型结果显示,本研究中共获得32种ST型,共发现9种新的ST型(8190、8222、8223、8831、8833、8841、8832、8834和8843)和6个新的等位基因(gln A606、gln A607、glt A518、gly A680、pgm863和unc A541)。进化树结果显示,空肠弯曲菌与结肠弯曲菌遗传关系相差甚远,聚集归为两个大群,分别有5个分支和3个分支。【结论】安徽6个地区不同来源的空肠弯曲菌与结肠弯曲菌均有丰富的基因型,且没有明显优势的基因型。从遗传变异的角度来看,空肠弯曲菌复杂多样,结肠弯曲菌相对保守。     

47株空肠弯曲菌湖北禽源株的多位点序列分型

【目的】为了解湖北地区家禽空肠弯曲菌的流行状况及其分子特征,应用多位点序列分型方法对2013–2014年的47株禽源空肠弯曲菌湖北分离株进行分子分型研究。【方法】以空肠弯曲菌的7个管家基因aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA为目的基因,提取样本基因组后PCR扩增,测序和分析。将测序结果上传数据库进行比对,制作成多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)遗传进化树。【结果】分离株共有38个ST型,10个克隆群,其中最多的克隆群为ST-353CC和ST-464CC,发现2个新的等位基因编号和25个新的ST型。遗传进化树显示,不同家禽宿主中空肠弯曲菌序列型存在一定的差异,不同地区和来源的空肠弯曲菌呈现出遗传多样性。【结论】本研究对湖北分离的47株禽源空肠弯曲菌进行了MLST分析,其结果显示菌株多样性较为丰富,将为我国家禽空肠弯曲菌的流行病学调查提供科学的数据。     

空肠弯曲菌fliD基因突变株的构建及其生物学特性

【目的】研究fliD基因对空肠弯曲菌生物学特性的影响,为阐明该基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】利用同源重组技术构建fliD基因的插入失活突变株NCTC11168△fliD,并通过与野生株比较,对fliD突变株生长速率、运动力、黏附力和侵袭力等生物学特性进行研究。【结果】与野生型NCTC11168相比,突变株NCTC11168△fliD的生理生化特性不变;突变株的生长速率无明显变化;MH半固体穿刺实验中,突变株只能在接种处生长,运动力明显减弱;在Caco-2细胞黏附、侵袭实验中,fliD突变株的黏附率和侵袭率分别为164.00±19.49、55.00±6.09,fliD基因失活使得突变株的黏附率和侵袭率显著降低(0P0.01)。【结论】fliD基因是空肠弯曲菌运动能力重要的分子基础,与空肠弯曲菌感染细胞的黏附侵袭作用密切相关,即与空肠弯曲菌的致病性密切相关。     

免疫捕获PCR法快速检测金黄色葡萄球菌

旨在建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)免疫捕获PCR技术,并探讨其灵敏度和特异性。SA特异性抗体包被PCR管以富集待测样品中目标菌,之后在同一PCR管里直接进行免疫捕获PCR,并和直接PCR比较。免疫捕获PCR法可特异性检测2株SA菌株,而无法检测到其它8种常见食源性致病菌,说明该方法对SA具有良好的特异性;该方法对纯菌液而言,检测灵敏度可达到2.35×102CFU/mL,是直接PCR的100倍;对5种食品模拟带菌检测发现,无需增菌培养,其灵敏度可达到2.35×103-2.35×104CFU/mL,是直接PCR的10-100倍。免疫捕获PCR法集免疫学与分子生物学检测技术于一体,具有高特异性、高灵敏度、检测快速、易于操作、成本低廉等诸多优点,是一种适合基层实验室使用的检测技术。     

空肠弯曲菌Ⅵ型分泌系统研究进展

Ⅵ型分泌系统(TypeⅥSecretion System,T6SS)是一种倒置于细胞膜上的类噬菌体样结构,能够输送效应蛋白并在定殖和生态位建立中发挥作用。近年来,在空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中发现了T6SS同源基因且能够表达组装成结构完整的T6SS,但T6SS对空肠弯曲菌的毒力影响尚不清楚。本文就空肠弯曲菌T6SS结构组成、分布特征及效应功能等方面的研究进展进行综述,以期为进一步解析空肠弯曲菌毒力因子的调控机制提供新思路。