人成骨肉瘤MG-63细胞在HMBA诱导分化后核基质蛋白表达的变化

HMBA诱导处理人成骨肉瘤MG-63细胞分化后,选择性抽提核基质蛋白,经双向凝胶电泳技术分析．共有12个蛋白点表达发生变化,经肽指纹图谱分析鉴定了9个蛋白质,其中,MHCⅡ类抗原、IFN刺激的基因因子3α蛋白、DKFZp434M2221．1蛋白、8-羟基-鸟嘌呤糖基化酶同功酶oggl和波形蛋白表达上调,hnRNP A2/B1和肌动蛋白表达下调,60S核糖体蛋白L21和ST2蛋白仅在分化的MG-63细胞中表达。研究结果表明肿瘤细胞增殖分化过程中伴随核基质蛋白表达的变化,并为深入揭示核基质蛋白与细胞癌变和逆转的关系以及阐明细胞增殖分化的基因表达调控原理提供了依据。     

姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡过程中hnRNP A2/B1表达与定位

姜黄素(curcumin)诱导处理的人成骨肉瘤MG-63细胞,在光镜和电镜观察细胞凋亡的基础上,对hnRNP A2/B1在核基质中存在、分布及其与凋亡相关基因产物在MG-63细胞中的共定位关系进行了研究.经姜黄素处理后,细胞出现染色质凝聚、细胞核固缩、凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征;双向凝胶电泳和质谱鉴定结果显示,hnRNP A2/B1存在于MG-63细胞核基质蛋白组分中,在姜黄素处理后细胞核基质蛋白中表达下调.蛋白质印迹杂交结果,证实hnRNP A2/B1在姜黄素处理前后的MG-63细胞核基质蛋白中的存在及其表达下调变化.免疫荧光显微镜观察显示,hnRNP A2/B1定位于MG-63细胞核基质纤维上,经姜黄素处理后出现分布位置与表达水平变化.激光扫描共聚焦显微镜的观察结果显示,hnRNP A2/B1在MG-63细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2、Fas和p53等基因产物具有共定位关系,且其共定位区域发生了变化.研究结果证实了hnRNP A2/B1定位于核基质纤维上,是一种核基质蛋白,在姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63凋亡过程中的表达与分布变化及其与凋亡相关基因的关系显然对MG-63细胞凋亡具有重要影响,这为深入揭示肿瘤细胞凋亡的机制提供了重要科学依据和深入探索的新方向.     

内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制研究北大核心

[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P<0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。     

核内不均一核糖核蛋白在前体mRNA加工中的功能

核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)是一类存在于真核生物体内具有类似结构特征的高丰度RNA结合蛋白,一般均匀分布在核内。多种hnRNP具有多样的功能,参与从转录调节,前体mRNA剪接,mRNA输出到mRNA降解等多种生物过程,从而进行基因表达调控。现着重介绍hnRNP在前体mRNA加工过程(加帽,剪接,加尾,输出,选择性降解)中的功能及研究进展。     

PTSD促进大鼠中缝背核细胞色素c表达

目的研究创伤后应激障碍(PTSD)大鼠中缝背核神经元细胞色素C(Cyt-c)的表达变化。方法应用无连续单一刺激(SPS)方法建立PTSD大鼠模型,随机分为SPS刺激后1d、4d、7d和对照组,应用酶组织化学法和RT-PCR方法观察中缝背核神经元Cyt-c的表达变化。结果光镜酶细胞化学法和RT-PCR法显示中缝背核神经元Cyt-c染色阳性细胞于SPS刺激后1d明显高于对照组,4d逐渐增高,并于7d达到高峰。电镜下显示Cyt-c阳性反应产物主要分布在中缝背核神经元线粒体膜,SPS刺激后可见Cyt-c释放到胞浆中。结论 SPS刺激引起Cyt-c在PTSD大鼠中缝背核神经元呈过表达。     

氧化性低密度脂蛋白对人单个核细胞Toll样受体表达及炎症介质的影响

目的:探讨氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)对单个核细胞Toll样受体1～10(TLR1～10)表达的影响及对炎症因子TNF-α、IL-6的调控作用。方法:用逆转录-聚合酶链反应检测健康人单个核细胞中TLR1～10 mRNA的组成型表达;用实时定量-聚合酶链反应检测ox-LDL刺激单个核细胞后,TLR1～10mRNA表达的变化;结合抗体阻断实验,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中TNF-α和IL-6的含量。结果:人单个核细胞有TLR1～10 mRNA的组成型表达,ox-LDL刺激可上调人单个核细胞TLR2、TLR4 mRNA的表达。经ox-LDL刺激后,单个核细胞分泌TNF-α、IL-6上升,受体阻断剂阻断TLR2、TLR4后,可以减少ox-LDL诱导的TNF-α、IL-6分泌。结论:ox-LDL可能是TLRs的内源性配体,ox-LDL可通过TLR信号通路调节单个核细胞炎性细胞因子的生成。     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

小鼠卵细胞质对供体核DNA甲基化和U2afbp-rs基因表达的调控

利用细胞核移植技术将NIH3T3细胞核和孤雌桑椹胚单个卵裂球,分别移植到去核MⅡ期受体卵母细胞中,通过免疫荧光染色后比较体外受精胚、孤雌胚、NIH3T3核移植重组胚和孤雌桑椹胚核移植重组胚附植前各时期胚胎DNA甲基化水平的变化,以探明克隆胚细胞核去分化与DNA甲基化的相互关系.利用Real-timePCR技术检测体外受精胚、孤雌胚和孤雌桑椹胚核移植重组胚附植前各时期胚胎中,印记基因U2afbp-rs基因以及非印记基因eIF-4C基因表达量的变化,以探明小鼠卵细胞质对克隆胚细胞核中印记基因表达的调控.结果表明,克隆胚供体核基因组DNA在核移植后并没有发生主动去甲基化.孤雌桑椹胚核移植后重组胚中U2afbp-rs基因和eIF-4C基因的表达水平要显著低于对照孤雌胚,但其表达量变化规律与对照孤雌胚相同,说明了卵细胞质对供体核印记基因的表达具有一定的调控作用.     

hnRNP U复合物结构及功能

核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPs）是一组RNA结合蛋白,它们与人体健康密切相关,参与肿瘤发生、病毒感染、细胞凋亡等多种病理生理过程的调节.hnRNP U是其中分子量最大的磷酸化蛋白质,对基因的转录、定位和表达特别是性染色体的表观失活过程发挥着重要作用.hnRNP U多以DNA/RNA蛋白复合物形式参与细胞功能调节.     

人椎间盘髓核来源的诱导多能干细胞重编程及功能的研究

椎间盘退变始发于髓核组织,获得足够有功能的髓核细胞是研究及治疗椎间盘退变的关键.而人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)不仅为建立疾病模型以研究疾病发生发展机制开辟了道路,还在再生医学领域展现出了广阔的应用前景.我们首先从椎间盘退变患者微创手术获得的髓核组织内分离髓核细胞,将携带OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的仙台病毒(Sendai virus,Se V)转染髓核细胞,重编程获得iPSC.通过检测多能细胞特异性标志、体内成瘤实验、甲基化及核型分析对所获得的iPSC进行鉴定.并以皮肤成纤维细胞来源iPSC作为对照,在二维和三维水凝胶中对iPSC进行定向分化,检测髓核细胞相关蛋白和基因的表达,比较分析2种iPSC向髓核细胞的分化效率.结果显示,iPSC能表达多能细胞特异性标志,具有正常的二倍体核型,畸胎瘤实验显示三个胚层的出现.诱导分化后的iPSC表达髓核相关基因和蛋白,在水凝胶中诱导培养后,iPSC表达更多的髓核相关基因和蛋白.髓核来源的iPSC与成纤维细胞来源的iPSC相比,可表达更多的髓核相关基因和蛋白.本研究首次将患者退变髓核细胞重编程成iPSC,并在水凝胶内将其诱导分化为髓核样细胞,为椎间盘退变个体化细胞治疗奠定基础.     

体内转录的多聚腺苷酸加速外源基因mRNA的出核转运

目的:探索体内转录的短多聚腺苷酸[poly(A)]对外源基因mRNA的表达及出核转运的影响。方法:构建依赖于H1启动子体内转录的poly(A)载体,用脂质体转染方法将其与外源绿色荧光蛋白(GFP)基因表达质粒导入MCF-7细胞,采用qPCR和Western印迹分别检测GFP在mRNA和蛋白水平的表达情况,并通过体外实验检测体内转录的poly(A)对GFP mRNA的加尾影响;采用qPCR法考察16种内源基因的mRNA水平;将其与p53表达质粒共转染MCF-7细胞后,采用MTT法检测细胞增殖情况。结果:在MCF-7细胞中,依赖于H1启动子转录的poly(A)能够加速外源GFP mRNA的poly(A)加尾,促进其从细胞核向细胞质输出,从而提高12 h内GFP的表达量,对内源基因mRNA水平没有影响;它还能加速外源p53基因的表达。结论:建立了通过体内转录poly(A)从而加速外源基因表达的策略,可能对基因治疗或快速研究某个特异基因的功能具有重要的应用价值。     

核基质结合序列（MAR）与基因表达调控

核基质结合序列（MAR）是能在体外与核基质特异结合的DNA序列,广泛存在于染色质Loop结构的边界序列中。随着研究的深入,发现MAR序列不仅在染色质折叠中起到重要作用,影响邻近内源基因表达,而且将MAR序列构建到外源基因表达盒两侧转化动植物时,也影响外源基因的表达。因此,MAR序列是基因组中一种重要的基因间边界序列,为阐明非编码序列在基因表达中的作用和构建真核生物高效表达载体提供了新途径。     

核定位信号筛选系统的构建

建立了一酵母克隆系统用于克隆含核定位信号 (NLS)的蛋白质的基因 .用表达转录因子GAL4 DNA结合域 - p53(GAL4- DBD- p53)融合蛋白的质粒转化酵母 HF7c,使 GAL4- DBD- p53可结合于报告基因的启动子但因无转录激活域而不能激活转录 .构建一酵母穿梭载体 ,可表达无NLS的 GAL4转录激活域 -大 T抗原 (GAL4- AD- LT)融合蛋白 .融合蛋白基因的下游插入一多克隆位点 .将 c DNA文库插入多克隆位点后 ,如果 c DNA片段可编码 NLS,则 GAL4- AD- LT分子可进入细胞核 ,并通过 LT与 p53的相互作用而使 GAL4- AD结合于启动子和激活报告基因的转录 .构建了这一克隆系统的各质粒 ,并用绿色荧光蛋白 (GFP)验证了其对核内蛋白和胞浆蛋白的甄别能力 .这一系统将有助于从 c DNA文库中筛选编码带有 NLS的蛋白质的基因     

内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制研究

[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。     

特异小干扰RNA敲除PLK1基因的表达

为研究特异小干扰RNA（siRNA）作用于大肠癌细胞株SW480中PLK1 (Polo-like kinase 1)基因表达的mRNA对该细胞分裂生长的影响,设计了对应于PLK1基因表达mRNA不同位点的10种特异siRNA,经化学合成后,用脂质体转染SW480细胞,实时定量PCR检测PLK1基因的表达,观察不同的siRNA作用强度,并计数细胞了解相应细胞的生长情况,western-blot观察PLK1表达蛋白的变化和流式细胞计数分析细胞周期改变。发现10种siRNA均可敲除PLK1基因表达的20 %以上,其中P1、P4和P9 3组敲除mRNA达80 ％以上,这3种siRNA及其混合物对PLK1基因mRNA的作用具有相应浓度效应,在25 nmol/L时达到最佳作用效果,而且相同浓度的混合物作用效果更好（超过95%）,PLK1表达蛋白质明显降低,细胞周期在G2期受到阻碍。72 h后的各种siRNA浓度下细胞生长变化与PLK1基因的mRNA水平变化相一致。结果表明化学合成的特异siRNA对SW480细胞中PLK1基因表达具有消除作用,混合物作用更强,在细胞水平上抑制了SW480细胞的分裂生长。     

针对核因子-kB P65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的:构建针对人核因子kB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制NF-kB P65基因表达的作用.方法:根据shRNA设计原则,在人NF-kB P65全长序列中选取合19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER.retro.neo中,构建针对NF-kB P65基因的shRNA表达载体.经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞.分别采用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果.结果:限制性酶切和基因测序证实针对人NF-kB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF-kB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制.结论:成功构建了NF-kB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF-kB P65的表达.     

周期性机械应力对髓核细胞增殖和细胞外基质表达的影响

目的:探讨周期性机械应力对髓核细胞增殖和细胞外基质表达的影响。方法:对兔髓核细胞进行体外细胞培养,对细胞施加周期性机械应力(0.25Mpa,0.1Hz)。实验分为2组,不加压组和加压组,不加压组置于单纯旋转式生物反应器内,加压组每天置于周期性机械应力场内2小时。分别于3天,7天检测细胞数目以及聚集蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原的基因表达。结果:髓核细胞的增殖和聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原基因的表达水平与周期性压力密切相关,在周期性机械应力刺激下髓核细胞增殖明显,细胞外基质的分泌增加,组织工程髓核细胞的活性显著提高。结论:周期性机械应力能够显著促进髓核细胞增殖,同时上调聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的基因的表达。     

人咽鳞癌Fadu细胞RNA负载人树突状细胞后体外诱导特异性CTL的研究

目的:探讨咽鳞癌细胞总RNA转染的树突状细胞(DC)疫苗体外诱导特异性抗肿瘤免疫的能力.方法:分离人脐血单个核细胞,经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人IL-4(rhIL-4)诱导不成熟DC(iDC),提取人咽鳞癌细胞FaDu总RNA后,转染入人iDC,成为FaDu RNA/DC疫苗,用流式细胞仪检测DC表面分子CD40、CDS0、CD83、CD86、HLA-DR的表达,混合淋巴细胞反应测定DCs刺激同种异基因T细胞增殖能力.用LDH法评估转染肿瘤总RNA的DC瘤苗的细胞毒性T淋巴细胞反应.结果:与转染前比较,人咽鳞癌细胞FaDu总RNA转染后脐血单核细胞来源DCs表面CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子水平明显升高(P均<0.05);可显著促进T细胞增殖,在体外能诱导高效而特异的抗下咽癌免疫效应(P<0.05).结论:人咽鳞癌细胞的总RNA转染的DC肿瘤疫苗能诱导CD8+,CD4+T细胞免疫,是较有临床应用前景的下咽癌免疫治疗方法.     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。