新型冠状病毒PLpro蛋白酶结构与功能的生物信息学分析

2019年12月,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在中国武汉暴发。SARS-CoV-2的基因组编码2种病毒蛋白酶,即木瓜样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和3C样蛋白酶(3C-like protease)。其中PLpro是SARS-CoV-2复制酶复合体(RC)形成的重要调节蛋白分子,对于病毒基因组转录和复制至关重要。因此,将SARS-CoV-2 PLpro作为药物的靶点对COVID-19的治疗具有积极意义。本研究应用生物信息学工具分析新型冠状病毒的木瓜样蛋白酶的结构和功能,首先利用BLAST和BioEdit获取SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶(SC2-PLpro)及其同源蛋白的氨基酸序列,并利用BLAST和MEGA 6.0进行同源性分析。之后,利用ProParam和Proscale分别对SC2-PLpro蛋白酶的理化性质、亲水性和疏水性进行分析。然后,通过SOMPA、ScanProsite和InterPro分别预测SC2-PLpro蛋白酶的二级结构和功能区域,进一步利用SignalP 4.0和TMHMM对SC2-PLpro蛋白酶的信号肽和跨膜区进行分析。最后,通过SWISS-MODEL对SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶进行三级结构同源建模。结果显示,对SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶与已报道的PLpro蛋白酶进行多序列比对后,发现SARS-CoV-2 nsp3的746~1063段氨基酸与多种冠状病毒PLpro蛋白酶氨基酸序列高度相似。同时,同源性分析发现SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒的PLpro蛋白酶具有同源性,其中与QHR63299、AVP78030相似性最高。对SC2-PLpro进行理化性质预测结果显示,其由318个氨基酸所组成,为稳定亲水性蛋白。二级结构预测结果显示SC2-PLpro主要含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,四种结构贯穿整条氨基酸链。进一步进行功能分析,发现其具有完整的催化三联体、锌结合域、泛素样N末端结构域,故推测该蛋白具有去泛素化的功能。然后,信号肽假说和跨膜结构域分析结果表明,SC2-PLpro既不是分泌蛋白,也不属于跨膜蛋白。本研究提示,生物信息学分析SC2-PLpro为稳定性亲水蛋白,属于非跨膜蛋白,比较保守,具有去泛素化的功能,利用此功能可以进一步规避宿主的固有免疫反应。通过制备PLpro蛋白酶小分子抑制剂,可能有助于治疗新型冠状病毒肺炎。     

新型冠状病毒3C样蛋白酶结构和功能特征分析

采用生物信息学方法分析新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)3C样蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease, 3CL^pro)的理化性质、结构与功能,为抗SARS-CoV-2药物研发提供参考。通过ProtParam、ProtScale、Bioedit服务器对3CL^pro进行一级结构如氨基酸理化性质、疏水性的预测分析;COILS Server、SignalP、TMPred、TargetP Server、NetPhos Server、NetNGlyc Server服务器对3CL^pro结构进行如卷曲螺旋区、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点的预测分析;SOPMA、SWISS MODEL服务器对3CL^pro进行二级结构、三级结构的预测分析;IEBD对3CL^pro进行B细胞表位的预测分析。3CL^pro由306个氨基酸组成,其中亮氨酸占比最高,分子质量为33 796.64,理论等电点值为5.95,半衰期为1.9 h,脂肪系数为82.12;亲水性较高,不具有卷曲螺旋区与信号肽特点,含一个跨膜区;具有4个磷酸化位点,2个糖基化修饰点;二级结构中无规则卷曲占据主导地位,三级结构能与已知的6y2g.1（SMTL ID）模型同源建模;存在4个潜在的B细胞表位,位于92~101位的氨基酸区域应答频率最高。利用生物信息学技术分析3CL^pro的结构和功能特征,可为新型冠状肺炎药物的研发提供参考。     

新型冠状病毒基因组结构与蛋白功能

2019年12月以来,武汉市暴发新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情并迅速蔓延全国,2020年1月30日被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)列为“国际关注的突发公共卫生事件”(public health emergency of international concern,PHEIC)。核酸序列分析证明COVID-19由新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)引起。2019-nCoV为正链单链RNA病毒,基因组长约30 kb,两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区。非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame,ORF)1a和ORF1b基因,编码16个非结构蛋白(non-structural proteins,NSP),即NSP1～16。结构蛋白编码区主要编码刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白。深入了解2019-nCoV基因组的结构和蛋白功能,将为2019-nCoV相关的病毒溯源、复制增殖、致病免疫、药物与疫苗研发以及当前疫情的防控提供有力的支撑。     

新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析

采用生物信息学方法分析预测新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)跨膜蛋白酶丝氨酸2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)的理化特性、结构特征和抗原表位,为抗SARS-CoV-2药物研...     

绿脓杆菌外膜蛋白OprF的生物信息学分析

[目的]利用生物信息学方法预测绿脓杆菌外膜蛋白OprF的理化性质、高级结构和细胞表位。[方法]采用在线软件预测OprF蛋白的理化性质;Signal P 4.1软件预测OprF信号肽序列;利用TMHMM软件预测ACFA蛋白跨膜结构;SOPMA服务器预测蛋白的二级结构;Swiss-Model程序预测OprF三维结构;综合ABCpred与Bepi Pred方案预测OprF的B细胞表位;运用神经网络法预测OprF的CTL表位;使用MHC-Ⅱ类分子结合肽程序预测OprF的Th细胞表位。[结果]OprF为亲水性蛋白;1~24位氨基酸为信号肽序列;存在多个酶切位点;无跨膜结构并定位于细胞膜外;二级结构中含无规则卷曲34.36%、α-螺旋31.90%、β-转角11.66%、β-片层22.09%;并可能存在3个B细胞表位、2个CTL表位、4个Th细胞表位。[结论]系统分析了OprF蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、二级与三级结构,以及B、T细胞抗原表位。     

新冠病毒刺突糖蛋白结构与功能的生物信息学分析及原核表达

SARS-CoV-2是一种高致病性且传播迅速的病原体,通过刺突糖蛋白(Spike glycoprotein,S蛋白)识别宿主细胞表面的受体来实现入侵和感染。对S蛋白进行系统的生物信息学分析和原核表达,有助于深入理解S蛋白的功能和阐明该蛋白介导病毒感染的分子机制。本文采用Protparam、Pfam、TMHMM、ExPASy-ProtScale、PSORTⅡ、SignalP、UniProt、NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0和BLAST等生物信息学软件和数据库对S蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰及相互作用网络等生物学特性进行了系统分析。利用Clustal X2和MEGA7.0软件对该蛋白进行了基于氨基酸序列的同源性分析和系统进化分析。最后,通过分子克隆技术构建重组表达载体pET-22b-S并进行原核表达。结果显示,S蛋白由1273个氨基酸组成,分子量141.2 kD,等电点6.24,有两个卷曲螺旋结构,一个跨膜螺旋区,疏水性较强。S蛋白包含刺突受体结合结构域和S2糖蛋白结构域,主要分布于宿主细胞的内质网膜和细胞膜,含有136个潜在的磷酸化位点和20个可能的糖基化位点。与SARS-CoV-2 S蛋白序列一致性最高的是SARS冠状病毒、SARS冠状病毒WH20和蝙蝠冠状病毒HKU3,均为76%。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒聚为一大支,提示它们可能具有共同的祖先。S蛋白主要在细菌裂解液离心之后的沉淀中表达,这为后续的结构分析和疫苗研发奠定了基础。S蛋白在SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒之间保守性较高,提示其在病毒入侵过程中具有重要功能。SARS-CoV-2与SARS冠状病毒和蝙蝠冠状病毒可能具有共同的祖先。本研究为SARS-CoV-2 S蛋白的表达纯化、结构与功能研究提供了重要的数据基础,有助于全面揭示S蛋白的生物学功能,同时为设计和筛选靶向S蛋白的新型抗病毒药物提供了科学依据。     

乙型肝炎病毒S蛋白的序列特征分析

乙肝病毒S蛋白是病毒的包膜蛋白,与病毒进入细胞有关,它存在逆转录过程并且具有极强的潜伏性。本论文应用生物信息学分析乙肝病毒S蛋白的序列特征,利用在线分析软件预测乙肝病毒S蛋白的理化性质和亲疏水性、跨膜区域、信号肽特征、磷酸化位点、二级结构以及乙肝病毒S蛋白的最佳抗原表位形成位置等。结果显示了乙肝病毒S蛋白由226个氨基酸组成,理论等电点是8.21,为不稳定蛋白,总平均亲水性为0.649,是疏水蛋白质,并且该蛋白存在信号肽,有4个跨膜区,有30个潜在的磷酸化位点,主要二级结构为α螺旋和无规则卷曲,同时,结合乙型肝炎病毒S蛋白的序列可及性、线性表位、β转角、柔性、抗原性的预测结果,可以找到潜在的抗原表位区域,为乙型肝炎的表位疫苗研制提供重要的参考依据,有利于进一步对乙型肝炎S蛋白的抗原性进行研究。     

羊口疮病毒安徽株VIR基因克隆与 生物信息学分析

目的获取并分析ORFV AH-F10株VIR基因序列及预测其编码蛋白的生物信息学特点。方法利用实验室保存的羊口疮AH-F10株,设计VIR基因引物并进行PCR扩增、克隆及序列测定,同时利用生物信息学方法对其编码的蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域以及线性细胞表位进行预测。结果 AH-F10-VIR基因长552bp,编码183个氨基酸,与Nantou株的VIR基因同源性最高,核苷酸同源性高达99.6%,氨基酸同源性为100.0%。生物信息学分析结果显示编码的蛋白相对分子量为19.88kDa,等电点为4.83,为亲水性蛋白;α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链分别占36.07%、3.83%、43.17%和16.94%;三级结构预测显示VIR蛋白存在较多的α-螺旋与无规则卷曲,同二级结构预测结果相符;含有17个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构区域,有15个潜在的B细胞优势表位,4个CTL细胞表位以及5个Th细胞表位。结论成功克隆了羊口疮安徽株VIR基因并预测了VIR蛋白的生物信息学相关信息,为进一步研究VIR蛋白奠定了基础。     

白念珠菌细胞壁蛋白Csp37抗原表位预测

目的预测白念珠菌细胞壁蛋白Csp37的抗原表位,分析其作为疫苗靶点的免疫原性。方法采用生物信息学方法对Csp37蛋白的抗原表位进行预测,利用ProtParam网络服务器分析蛋白基本理化性质,SignaIP 3.0预测信号肽,TMHMM软件预测跨膜区,GOR4在线分析蛋白二级结构,DNAStar预测分析亲水性、可塑性、表面可及性和氨基酸抗原指数,使用在线工具ABCPred预测B细胞抗原表位,Syfpeithi预测T细胞抗原表位。最后,综合分析B细胞和T细胞共有抗原表位。结果预测白念珠菌细胞壁蛋白Csp37的B细胞表位9个和T细胞表位8个,以及共有的优势抗原表位5个,共同优势区域为:45-48,76-78,153-158,222-225,303-305位氨基酸。结论白念珠菌细胞壁蛋白Csp37含有丰富的抗原表位,具有诱导细胞免疫应答和体液免疫应答的潜能,可以作为疫苗研究的新靶点。     

2019新型冠状病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位点

2019年12月,中国武汉报道了2019新型冠状病毒(2019 novel Coronavirus,2019-nCoV)引起的肺炎。基于基因组信息,我们前期研究结果显示2019-nCoV与SARS冠状病毒虽然同属于Beta冠状病毒B亚群(BB冠状病毒),但两种病毒差异较大,这一结果与两者临床症状差异一致。前期研究还发现了BB冠状病毒存在大量的可变翻译,并从分子水平揭示了BB冠状病毒变异快、多样性高的特点。本研究在国际上首次报道Beta冠状病毒S蛋白上的一个重要突变,这个突变使2019-nCoV具有了一个可供Furin蛋白酶切的位点,是大部分Beta冠状病毒(特别是SARS和SARS样(SARS-like)冠状病毒)所不具有的。我们的一个结论是这个突变有可能增强了2019-nCoV侵染细胞的效率,进而使其传播力显著大于SARS冠状病毒。由于这个突变,2019-nCoV的感染机制也会不同于SARS等大部分Beta冠状病毒,而与鼠肝炎冠状病毒、HIV、埃博拉病毒和一些禽流感病毒的感染机制更相似。我们意外发现一些禽流感病毒也可以通过突变获得Furin蛋白酶切位点,这说明自然突变可以引入Furin酶切位点。除此之外,在2019-nCoV的S蛋白中插入的"CGGCGG"序列编码两个精氨酸,然而"CGG"对于宿主(人)来说是蛋白质翻译的稀有密码子。我们的另一个结论是引入Furin蛋白酶切位点的插入突变中包含的"CGGCGG"是传播到人之前形成的;2019-nCoV的中间宿主应该是密码子"CGG"相对使用频率更高的哺乳动物。使用我们提供的密码子"CGG"相对频率表结合2019-nCoV检测阳性的动物样品信息可以准确地确定2019-nCoV的中间宿主。对这个重要突变的后续研究将为揭示2019-nCoV传播力强的原因,以及为药物、抗体和疫苗的开发等工作奠定基础。     

Analysis of Local Structure in the D2/S1–S2 Region of the Rat Skeletal Muscle Type 1 Sodium Channel Using Insertional Mutagenesis

Abstract: A reporter epitope was inserted at 11 positions in a region encompassing proposed transmembrane segments S1 and S2 in the second repeat domain (D2) of the rat skeletal muscle type 1 sodium channel. All mutations produced full-length membrane-associated protein following transfection into cultured cells, although the level of expression varied with insertion position. Characterization of cognate cRNAs for each mutation in Xenopus oocytes by two-electrode voltage clamp defined a permissive region between the proposed transmembrane regions in which these large insertions did not interfere with channel function. Two of the mutations, in which the point of insertion was within the proposed S1–S2 loop, demonstrated extracellular membrane labeling when studied either by antibody binding in oocytes or by confocal analysis following transfection into primary muscle cells. Our results define the likely boundaries of an extramembrane region linking the S1 and S2 transmembrane segments in D2 and confirm the extracellular location of this S1–S2 loop predicted by current models of channel tertiary structure.     

Inefficiency of Sera from Mice Treated with Pseudotyped SARS-CoV to Neutralize 2019-nCoV Infection

The novel coronavirus 2019-nCoV has caused the pandemic of Wuhan pneumonia recently, posing a serious threat to global public health, and thus calling for the development of therapeutics and prophylactics. Here we showed that high titer anti-SARS-CoV spike protein serum cannot effectively neutralize 2019-nCoV infection. Based on our previous research, we developed SARS pseudovirus (SARS-PsV) and MERS pseudovirus (MERS-PsV) as immunogens to immunize mice. We found sera from mice treated with SARS-CoV S protein could potently cross-neutralize infection by SARS-CoV (50% neutralizing antibody titers, NT50 > 40, 000) and SARS-related coronavirus (NT50 > 7, 000), but weakly for 2019-nCoV infection NT50 < 100), implying that it may not be practical to treat 2019-nCoV infection with anti-SARS-CoV antibodies and that people with history of SARS-CoV infection many years ago may not be resistant to 2019-nCoV infection.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Screening of inhibitors against SARS-CoV-2 spike protein and their capability to block the viral entry mechanism: A viroinformatics study

SARS-CoV-2, previously named 2019 novel coronavirus (2019-nCoV), has been associated with the global pandemic of acute respiratory distress syndrome. First reported in December 2019 in the Wuhan province of China, this new RNA virus has several folds higher transmission among humans than its other family member (SARS-CoV and MERS-CoV). The SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain (RBD) is the region mediating the binding of the virus to host cells via Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), a critical step of viral. Here in this study, we have utilized in silico approach for the virtual screening of antiviral library extracted from the Asinex database against the Receptor binding domain (RBD) of the S1 subunit of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Further, the molecules were ranked based on their binding affinity against RBD, and the top 15 molecules were selected. The affinity of these selected molecules to interrupt the ACE2-Spike interaction was also studied. It was found that the chosen molecules were demonstrating excellent binding affinity against spike protein, and these molecules were also very effectively interrupting the ACE2-RBD interaction.Furthermore, molecular dynamics (MD) simulation studies were utilized to investigate the top 3 selected molecules' stability in the ACE2-RBD complexes. To the best of our knowledge, this is the first study where molecules' inhibitory potential against the Receptor binding domain (RBD) of the S1 subunit of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein and their inhibitory potential against the ACE2-Spike has been studied. We believe that these compounds can be further tested as a potential therapeutic option against COVID-19.     

新型冠状病毒上海株(nCoV-SH01)的分离和鉴定

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情对人类生命健康构成极大威胁。病毒的分离是构建新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)细胞感染模型和动物感染模型的基础。本研究利用冠状病毒易感的Vero E6细胞,从1例上海感染者的咽拭子中分离到一株2019-nCoV,命名为nCoV-SH01。对该毒株全基因组采用一代Sanger和二代Illumina法测序,发现该毒株与GenBank MN908947的同源性＞99.99%。免疫荧光检测显示,该毒株与COVID-19康复者的血清呈阳性反应。当nCoV-SH01感染Vero E6细胞后,导致典型的合胞体病变,细胞病变效应明显且进展迅速,提示nCoV-SH01可用于进一步建立2019-nCoV的细胞感染和动物感染模型,为开展致病性研究以及抗病毒药物和疫苗研发奠定了基础。     

植物萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的橡胶、烟草、辣椒、穿心莲等植物的萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明该类酶基因的全长包括5′、3′非翻译区和一个开放阅读框,无信号肽,是一个跨膜的亲水性蛋白,包括两个功能HMG-CoA结合motif及两个功能NADPH结合motif,α-螺旋和不规则盘绕是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间布局上折叠成“V”形,“V”形的两臂由螺旋状的N结构域和S结构域构成,中间部分由L结构域构成。