马铃薯甲虫基因组SSR位点分析及引物效率的验证

SSR作为一种微卫星分子标记方法,被广泛用于遗传多样性相关的研究,而SSR引物是否高效是影响整个实验结果的重要因素。本研究利用生物信息学手段,对马铃薯甲虫基因组数据进行分析,搜索基因组SSR位点,并设计引物和验证SSR引物的效率。最终在马铃薯甲虫基因组中共检测出SSR位点81 937个,且这些位点中以单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重复为主;从SSR位点的平均分布距离来看,单、三、四核苷酸重复在马铃薯甲虫基因组中平均分布距离较小,分别为2.21 kb、8.39 kb、36.21 kb。马铃薯甲虫基因组SSR位点中,优势基序总数为68 388个,比例高达83.46%,其中,单核苷酸以A/T重复基序占绝对优势,二核苷酸重复的SSR位点中,以AG/CT重复基序为主,三核苷酸重复的位点中,以AAT/ATT重复基序为主;在ClassⅠ长度的SSR位点中,以二核苷酸、三核苷酸重复的数量最多,比例高达82.32%;最后设计19对SSR引物测试效率,其中14对成功扩增条带,11对为多态性引物,其平均多态性条带6.27条。多态性引物的PIC值在0.375-0.794,平均值为0.600,大于平均值的引物为6对,占有效扩增引物的54.5%。研究表明,利用生物信息发掘SSR位点的方法简便高效,这为后续进一步利用SSR引物研究马铃薯甲虫的遗传多样性,及在其它昆虫中开发SSR引物开发奠定研究基础。     

基于丹霞梧桐转录组数据的EST-SSR标记开发

以丹霞梧桐转录组序列为基础,开发丹霞梧桐EST-SSR标记位点,并利用其对丹霞梧桐群体进行遗传多样性分析,评价丹霞梧桐群体的遗传多样性水平,为丹霞梧桐的合理利用和保护提供依据。应用Primer 3.0、Gen Al Ex6.3、FSTAT和MS-tools等软件进行引物设计和相关遗传参数分析。17858个SSR位点分布于79920个unigene序列,SSR位点密度为1/4.78 kb。SSR重复基序中,三核苷酸(43.64%)为优势核苷酸,其次为四核苷酸(23.52%)和二核苷酸(15.54%)。三核苷酸和二核苷酸优势重复基序分别为AAG/CTT和AG/CT。以16个样本为材料,从设计的73对引物中共筛选出16对多态性EST-SSR引物,多态性信息含量(PIC)的平均值为0.546,所开发位点具有较高的多态性。主成分分析(PCA)表明,这些位点具有很好地鉴别不同地区样本,甚至单株的能力。3个群体的遗传多样性参数对比结果表明,丹霞梧桐群体具有中等程度的遗传多样性,其期望杂合度(He)的变化范围为0.550～0.605。地质、历史气候变化及人为干扰等因素可能是造成丹霞梧桐群体偏离哈代-温伯格平衡的主要原因。本研究所开发的EST-SSR多态性位点可为丹霞梧桐遗传结构分析和分子辅助育种等相关研究奠定良好基础。     

美洲南瓜转录组SSR信息分析及其分子标记开发

该文对美洲南瓜(Cucurbita pepo L.)开展转录组测序分析,共获得83 650条Unigene,利用MISA软件搜索1 Kb以上的15 356条Unigene,共检测出7 478个SSR位点,分布于5 786条Unigene中,出现频率为48.7%,平均分布距离为4.08 Kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR的47.90%、20.57%和22.36%。二核苷酸重复基序中以AG/CT为优势重复基序,三核苷酸重复基序以AAG/CTT为主。利用Primer 3.0共设计出5 786对SSR引物。从114对有效扩增引物中随机选择50对引物,对28个美洲南瓜种质进行多态性验证分析,其中35对(占70%)引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将28份供试材料分为2类。利用美洲南瓜转录组数据进行SSR标记开发能获得较高频率的SSR位点,且类型丰富,为美洲南瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。     

草鱼Ⅰ型微卫星标记的发掘及其多态性检测

表达序列标签(EST)是发掘Ⅰ型微卫星标记的重要资源。研究运用生物信息学方法,从草鱼头肾组织3027条EST序列中搜索到322个微卫星位点,占整个EST数据库的10.6%。其中,二核苷酸重复位点151个(46.9%),三核苷酸重复位点137个(42.5%),四、五、六核苷酸重复位点较少;在二核苷酸重复位点中,AC/GT重复位点最为丰富,占二核苷酸重复位点总数的50.3%,AG/CT重复次之,占二核苷酸重复位点总数的40.4%,AT和GC重复较少。10个微卫星位点的多态性检测结果显示,4个位点在草鱼测试群体中呈多态性,多态性位点的平均多态信息含量(PIC)和平均遗传杂合度(H)分别为0.5236和0.5441,其中,2个多态性位点的PIC值大于0.5,呈现高度多态性特征。Ⅰ型微卫星标记将为草鱼遗传连锁图谱构建和QTL分析提供有效的基因分子标记。       

基于转录组测序信息的水生植物莕菜SSR标记开发

利用软件MISA对水生植物莕菜转录组测序所获得的79536条EST序列进行分析,共检测出12319个EST-SSR位点。在莕菜的EST-SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的57.31%和30.87%,其中AG/CT、AAG/CTT分别是二、三重复单元类型的优势重复基元,分别占总SSR的29.76%和8.66%。随机挑选了130对EST-SSR引物对莕菜两个居群进行遗传多样性检测,结果发现：78对引物能扩增出清晰可分辨的条带,其中37对能成功检测出多态性,引物多态率为 47.44%。这些多态性引物共检测出114个等位基因,每个位点2~6个,平均3.08个。观测杂合度（H_o）及预期杂合度（H_e）分别在0.229~1.000和0.351~0.756之间,多态信息含量PIC值在0.286~0.698之间,平均达0.495。以上研究结果表明,通过莕菜转录组测序产生的EST数据来开发SSR标记是一种简单而高效的途径,这些新的SSR分子标记为研究莕菜的居群遗传多样性及其遗传结构提供了工具。     

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。     

中国麻风树种质资源SSR遗传多样性的研究初报

麻风树（Jatropha curcas）是世界上最有潜力的能源植物之一。本研究针对来自全国6省区的219份麻风树种质资源,应用SSR分子标记对其进行了初步的遗传多样性分析。根据公共数据库中的所有序列设计出了20对SSR及4对eSSR引物,这些引物均能很好地扩增麻风树DNA片段。在上述24个SSR标记中,有8个（33.33%）探测到麻风树群体的DNA多态性。这24个SSR标记共扩增出36个位点,平均每个标记扩增1.5个位点,其中12个（33.33%）位点显现出多态性。这表明中国麻风树是一个具有中等SSR多态性水平的物种,其多态百分率为33.3%。     

华仁杏幼果转录组SSR信息分析及其分子标记开发

为了解华仁杏微卫星(SSR)分布规律,开发EST-SSR引物,为华仁杏种质资源评价与辅助育种提供有效的鉴定标记。本研究采用生物信息学方法对华仁杏幼果转录组SSR位点的数量、频率、分布特征进行了统计分析;利用转录组数据进行了SSR引物的筛选和开发,并利用开发出的引物对华仁杏29个无性系进行了多态位点检测和鉴定。结果表明:华仁杏幼果EST-SSR的分布频率为19.21%,重复单元的重复次数分布在5~24次之间,优势重复基序为单核苷酸、2核苷酸、3核苷酸,分别占总SSR的19.81%、46.47%、32.49%。参试的139对引物中有39对引物可扩增出目标序列,其中24对引物可检测出多态性位点,占参试引物总数的17.27%。24对引物在29个华仁杏无性系中共检测出了170个等位基因位点,多态性信息含量(PIC)介于0.33~0.87之间,平均为0.64,其中高多态性引物19条,占多态性引物比例的79.2%。本研究对华仁杏转录组SSR信息进行了分析,并开发出了19对高多态性SSR引物,5对中多态性引物,为华仁杏种质资源评价及分子标记辅助育种提供了基础。     

山地虎耳草转录组SSR信息分析

利用MISA（MicroSatellite）软件对山地虎耳草转录组拼接序列进行微卫星位点信息分析,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测提供候选序列。结果发现,在拼接得到的63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00 kB出现一个SSR位点。山地虎耳草转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复（55.50%）,其次为二核苷酸重复（30.23%）。二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元分别为AG/TC和AAG/TTC。二核苷酸重复基元的重复次数类型最多,跨度最大,具有更高的多态性,三核苷酸次之,而四、五、六核苷酸重复类型很少。山地虎耳草转录组SSR以5~9次重复为主,且SSR数量随着重复次数的增加逐渐减少,基序长度主要集中于12~30 bp,多态性均在中等以上。     

椭圆叶花锚简化基因组的SSR信息分析及SSR引物开发

基于RAD-seq简化基因组测序技术获得椭圆叶花锚（Halenia ellipitica D.Don）简化基因组水平上的序列信息并开发SSR分子标记。利用SR search软件检测而得到双端各有至少100 bp的五种类型的SSR（二、三、四、五、六核苷酸）位点共6 201个,并成功设计其中3 865个SSR引物。在能成功设计引物的SSR位点中,三核苷酸SSR位点最多;重复序列长度包括17种（12~36 bp）;重复序列的基序共达316种,其中五核苷酸基序种类最多（91种）。从中挑选65对可对应五种SSR类型的引物,经梯度PCR检验后,利用椭圆叶花锚的4个居群32个个对可扩增的引物进行PCR和聚丙烯酰氨凝胶电泳检测,其中14对引物能在绝大多数个体中扩增,且13对具多态性。13个多态性位点的等位基因数量均值为5.462,多态性较高且不连锁（P<0.05）;其中10个位点在多数居群中偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01）且存在较高的纯合子数量（观测杂合度H_o均值0.226）;近交系数在-0.443~1,均值为0.656;基因流N_m为0.474。     

丝瓜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

对丝瓜(Luffa cylindrica)开展转录组测序分析,共获得58 073条unigene(序列总长约52 087 451 bp),共检测到8 693个SSR(simple sequence repeat)位点,平均分布距离为5.99 Kb;其中,SSR位点中主导类型为二核苷酸重复类型,占总SSR的45.89%;其次,三核苷酸重复类型,占38.89%。二核苷酸重复基序中以AG/CT为主,三核苷酸重复基序以AAG/CTT为主。通过Primer 3.0设计得到7 563对SSR引物,随机选择30对SSR引物,对32种不同来源的丝瓜进行多态性验证分析,其中,22对(占73.33%)引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将32份供试材料分为普通丝瓜和有棱丝瓜2类,这2类丝瓜可以进一步分别被分为2个亚群,丝瓜类群的划分与有无棱沟密切相关,与形状、颜色有较高的相关性。通过对丝瓜转录组分析可获得较高频率的SSR位点且类型丰富,为丝瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

基于转录组测序的枫香EST-SSR引物开发及有效性评价

枫香是广西重要的乡土树种之一，具有较高的用材、观赏及药用价值。为验证枫香SSR引物的实际应用效果，该研究基于转录组测序技术，检测枫香SSR位点并设计引物，通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出具有较高多态性的枫香EST-SSR引物，并对1个枫香天然群体进行遗传多样性分析。结果表明：(1)共发掘到23 777个SSR位点，单核苷酸重复类型SSR位点占总位点比例最高(46.54%),在重复次数上5～12次之间的SSR位点占比最高(72.36%)。(2)共开发出262对SSR引物，有效扩增率为53.1%,最终筛选出扩增稳定、条带清晰的引物18对。(3)多态性检测结果显示所有位点均具有多态性，天然群体遗传多样性结果显示该天然群体中等位基因数量(Na)、有效等位基因数量(Ne)、Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)变化范围分别为2～4、1.112 8～2.609 6、0.208 9～1.112 7和0.275 9～1.000 0,平均值分别为2.333 3、1.957 4、0.708 5和0.722 6。综上认为，枫香中占优势的SSR位点重复类型和重复基序与其他物种基本相同，所开...     

两种黄连转录组中SSR位点信息分析与多态性引物开发

本研究通过对两种黄连,即黄连(Coptis chinensis Franch.)和云南黄连(C.teeta Wall.)转录组中SSR位点信息的分析,设计SSR引物,为开发新的SSR标记提供理论基础。利用MISA工具筛选黄连及云南黄连转录组测序获得的55 903和49 741条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;Primer3设计SSR引物,随机选取60对引物对两种黄连,每种20株,共40株进行多态性扩增分析。黄连和云南黄连转录组分别搜索到4 071和4 041个SSR位点。两种黄连中二核苷酸和三核苷酸重复皆是主要的类型,分别占总SSR的87.71%和87.58%。黄连中,二核苷酸重复基元出现最多的为AG/CT,共953个,占总SSR的23.40%,三核苷酸重复基元出现最多的为AAG/CTT,共746个,占总SSR的18.3%;在云黄连中,AG/CT和AAG/CTT分别为934(23.10%)和773(19.10%)。随机选取60对引物进行PCR扩增,其中12对(20.00%)表现出多态性差异。利用Populations软件作图,将40个材料分为2类。两种黄连转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

伯乐树转录组SSR分布特征及其引物开发

基于伯乐树(Bretschneidera sinensis Hemsl.)转录组测序数据,采用生物信息学方法分析该物种转录组中SSR位点的分布特征,利用TP-M13-SSR (Simple sequence repeat with tailed primer M13)方法检测12株无亲缘关系样本SSR引物位点的多态性。结果显示,8772个SSR位点分布在6732条unigene序列上,SSR位点出现频率和分布密度分别为25.48%和1/4.39 kb。不同重复基元类型中,单核苷酸、2核苷酸和3核苷酸为主要SSR基元类型,SSR数分别占SSR总数的53.72%、29.42%和15.42%。其中,2核苷酸基元类型中,AG/CT基元出现的SSR位点最多,占总数的22. 21%; 3核苷酸基元类型中,AAG/CTT基元分布的SSR位点最为丰富,ACC/GGT和ATC/ATG次之。120对自主开发的SSR引物中,有68对扩增产物检测到目的片段,其中有49对引物位点呈现多态性,多态位点比例为72.06%;单个位点等位基因数目为2～7,平均单个位点等位基因数为3.55。研究结果表明基于转录组序列开发的伯乐树SSR位点多态性较高。     

基于转录组测序信息的水生植物蕃菜SSR标记开发

利用软件MISA对水生植物蓄菜转录组测序所获得的79536条EST序列进行分析,共检测出12319个EST—SSR位点。在蓄菜的EST—SSR中,二核苷酸和三核苷酸重复单元是主导类型,分别占总SSR的57．31％和30．87％,其中AG／CT、AAG／C1_r分别是二、三重复单元类型的优势重复基元,分别占总SSR的29．76％和8．66％。随机挑选了130对EST-SSR引物对蓄菜两个居群进行遗传多样性检测,结果发现：78对引物能扩增出清晰可分辨的条带,其中37对能成功检测出多态性,引物多态率为47．44％。这些多态性引物共检测出114个等位基因,每个位点2—6个,平均3．08个。观测杂合度（心）及预期杂合度（He）分别在0．229～1．000和0．351-0．756之间,多态信息含量PIC值在0．286～O．698之间,平均达0．495。以上研究结果表明,通过萏菜转录组测序产生的EsT数据来开发SSR标记是一种简单而高效的途径,这些新的SSR分子标记为研究苔菜的居群遗传多样性及其遗传结构提供了工具。     

65份野生油茶种质遗传多样性的ISSR和RAPD标记分析

利用ISSR和RAPD标记,对名邛台地野生油茶种质进行遗传多样性分析。从60条简单重复序列引物中筛选出16条引物,在65份样品中共扩增出213条带,其中多态位点为203个,多态位点百分率为95.31%;从30条寡居核苷酸引物中筛选出8条引物,共扩增出105条带,其中多态性位点94个,多态位点百分率为89.52%。结果表明:名邛台地野生油茶种质具有较丰富的遗传多样性,ISSR和RAPD标记可以应用于油茶种质遗传多样性分析。     

柑桔BES SSR标记开发及连锁图延伸和加密

为了系统性地开发和拓展柑桔SSR标记,通过对公布的柑桔BAC文库末端序列(BAC-End sequence,BES)进行SSR分析,选择1500个SSR位点设计合成并检测323对引物。结果表明:(1)从总长度为28.1 Mb的46 339条序列中共检测出22 403个SSR位点,约每2条序列就会出现一个SSR位点,发生频率为48%,相当于平均1.25kb的序列中就会出现1个SSR,频率约为柑桔EST的2倍,且不同核心重复序列的SSR发生特点与EST也不同。(2)所合成的323对引物中,有效扩增316对,扩增率约98%,173对表现多态性,总多态性比率约55%,多态性引物中单核苷酸重复类型15对,双核苷酸重复类型100对,三核苷酸及以上重复类型58对,表明柑桔BES中具有较为丰富的多态性SSR标记。(3)结合已发表的遗传作图数据,对总计349个多态性位点进行遗传连锁分析,获得的新遗传连锁图谱共含有9个连锁群、334个SSR标记、总长844.2cM、平均图距2.53cM,延长和加密了先前的图谱。该研究开发的新SSR标记为开展柑桔遗传鉴定分析和遗传图谱构建提供了新的标记来源,加密的遗传图谱为柑桔的基因定位、图位克隆和标记辅助育种等奠定了基础,SSR分析结果也为其他物种SSR标记的开发提供了参考。     

半野生大豆种质资源SSR位点遗传多样性分析

利用12对SSR引物对67份半野生大豆种质进行了遗传多样性的检测分析,结果表明,12个位点共检测到184个等位基因变异,平均每个位点等位基因数目为15．41个,平均多态性信息量,平均遗传多样性指数,平均遗传距离分别为0．849,0．706,0．118,根据SSR分析结果,按欧式距离将67份半野生大豆种质聚类并划分为5个组群。     

基于RNA-seq数据的窄足真蚋SSR分子标记开发

【目的】窄足真蚋Simulium(Eusimulium)angustipes属嗜血蚋种,并传播禽类疾病。本研究旨在通过RNA-seq技术获得窄足真蚋的转录组数据,进而开发其微卫星标记,为窄足真蚋的种群遗传学研究提供可靠的分子标记。【方法】以采自陕西宝鸡和新疆阿勒泰地区的窄足真蚋幼虫为材料,构建转录组数据库。使用软件MISA(microsatellite identification tool)搜索窄足真蚋unigenes库中的所有SSR位点,并随机挑选SSR位点,利用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.7设计微卫星引物。经PCR扩增和电泳检测,用Cervus 3.0.7等生物信息学软件进行统计分析,筛选多态性微卫星引物。利用Blast X比对Nr和Swiss-Prot蛋白质数据库,对含多态性SSR位点的unigenes进行功能注释。【结果】共鉴定出29 471个SSRs。最丰富的重复基序是单核苷酸重复类型,占总SSR数的87.05%;其次是三核苷酸重复类型,占7.95%。共发现34种碱基重复基序,主要是A/T基序重复,占86.93%。15对微卫星引物均成功扩增出特异性产物,含12对具多态性的微卫星分子标记。比对结果显示,7个SSR位点来自注释基因序列。【结论】基于RNA-seq二代测序技术可实现窄足真蚋SSR分子标记的高效率开发,对窄足真蚋的种群遗传学研究具有重要意义。     

基于转录组数据的密花香薷SSR位点特征分析

利用MISA软件对密花香薷转录组42 362条Unigene进行SSR位点搜索,并对其SSR序列结构及分布特征进行了分析。结果表明:(1)密花香薷转录组Unigene序列中共检测到17 564个SSR重复序列,分布于11 903条Unigene上,出现频率为28.10%,平均每3 200 bp出现一个SSR位点。(2)单、二、三核苷酸重复类型为密花香薷转录组SSR位点的主导基序类型,占总SSR位点的97.27%,3种主导基序类型中,单核苷酸所形成基元类型数量最多,共检测到169个基元类型(51.22%),单核苷酸(A/T)n基元类型占明显优势,二核苷酸重复类型(AG/CT)n基元类型占优,分别占总SSR位点的50.60%和12.17%。(3)单核苷酸SSR位点所包含重复次数最多(49),重复次数介于10～66,同一基序类型不同重复次数所形成的SSR位点数量差异较大,随重复次数的增加,SSR位点数呈下降趋势。(4)密花香薷转录组二至六核苷酸基序SSR序列长度集中在12～30 bp区间,共包含有8 190个SSR位点,占所统计SSR位点的95.60%,1 589 (≥20 bp)个SSR序列具有极高的多态性,占所统计SSR位点的18.54%。综合出现频率、分布密度、基元重复次数和长度变异等多个研究结果发现,密花香薷转录组检索到的SSR序列表现出较高的多态性潜能,具有较大的开发价值。该研究为后续密花香薷SSR分子标记引物开发奠定了理论基础。