美洲南瓜转录组SSR信息分析及其分子标记开发

该文对美洲南瓜(Cucurbita pepo L.)开展转录组测序分析,共获得83 650条Unigene,利用MISA软件搜索1 Kb以上的15 356条Unigene,共检测出7 478个SSR位点,分布于5 786条Unigene中,出现频率为48.7%,平均分布距离为4.08 Kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR的47.90%、20.57%和22.36%。二核苷酸重复基序中以AG/CT为优势重复基序,三核苷酸重复基序以AAG/CTT为主。利用Primer 3.0共设计出5 786对SSR引物。从114对有效扩增引物中随机选择50对引物,对28个美洲南瓜种质进行多态性验证分析,其中35对(占70%)引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将28份供试材料分为2类。利用美洲南瓜转录组数据进行SSR标记开发能获得较高频率的SSR位点,且类型丰富,为美洲南瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。     

龙眼顶芽转录组简单重复序列(SSR)标记信息分析及分子标记开发

随着新一代测序技术的发展,大量的转录组数据和表达序列标签(EST)成为开发简单重复序列(SSR)标记的可利用资源。本研究利用MISA软件筛选龙眼(Dimocarpus longan)顶芽转录组数据库序列,从114 445条龙眼转录组unigene序列中发现11 546个SSR位点,SSR出现频率为10.09%。其中1 975条unigene含有两个或两个以上EST-SSR位点,占所有SSR位点的比例为17.10%,SSR出现的平均距离为7.52 kb。从龙眼转录组SSR核苷酸基序类型来看,二核苷酸(52.11%)和三核苷酸(46.15%)出现频率最高,占所有核苷酸出现频率的99.26%。在龙眼转录组SSR中二核苷酸重复基元出现频率最高的是AG/CT(4 250个,占36.81%),三核苷酸重复基元出现频率最高的是AAG/CTT(1 109个,占9.61%)。对含SSR位点的9 571条unigene序列进行引物设计,共设计出了8 347对SSR位点特异引物。随机挑选合成50对EST-SSR引物,以‘石硖’、‘储良’、‘古山2号’、‘立冬本’等四份龙眼材料的基因组DNA为模板对这批引物进行PCR扩增、筛选,结果表明,其中21对引物能产生理想的PCR产物,有效扩增率为42%;16对引物扩增条带具有多态性,占有效引物的76.2%;16对多态性引物共扩增获得50个条带,其中多态性片段21个,每对引物平均产生1.31个多态性片段。     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

基于转录组序列的长柄双花木SSR标记开发

双花木属(Disanthus Maxim.)是金缕梅科(Hamamelidaceae)最原始的单种属,为东亚地区特有属。长柄双花木(D.cercidifolius var.longipes H.T.Chang)是日本特有植物双花木(D.cercidifolius Maxim.)的变种,仅分布于我国南方地区,为国家Ⅱ级保护植物,被列入我国濒危植物种名录,在研究金缕梅科系统发育和东亚植物区系地理演化等方面具有重要的科学价值。由于可利用的SSR标记引物数量不足,阻碍了长柄双花木遗传学研究。本研究对长柄双花木转录组序列进行高通量测序,采用de novo组装方法,共获得32325条unigene。利用MISA软件,搜索到13779个SSR位点,SSR位点发生频率为42.63%,位点分布频率为1/2.95 kb。不同重复基序类型中,二核苷酸重复基序数量最多,占总数44.10%;单核苷酸重复基序次之,占总数37.90%;三核苷酸重复基序,占总数16.71%。二核苷酸重复基序中,AG/CT重复基序数量最多;三核苷酸重复基序中,AAG/CTT重复基序数目最多,其次是ATC/ATG、ACC/GGT和AGC/CTG。从不同种群中任取1株构成8株无亲缘关系的随机样本,对随机合成的60对SSR引物的有效性进行琼脂糖电泳检测的结果表明,46对引物扩增出目的条带,扩增率达76.67%。进一步利用TP-M13-SSR技术基因分型结果显示,30对引物扩增产物显示出多态性,多态位点百分比为65.22%。这表明,基于转录组序列开发的长柄双花木SSR位点多态性较高。本研究结果有助于后续的长柄双花木种群遗传学及系统进化等方面研究。     

美味牛肝菌全基因组SSR位点的分布规律研究

研究利用生物信息学方法对美味牛肝菌全基因组中的SSR位点进行了统计分析,并与其他3种担子菌基因组(灰盖鬼伞、裂褶菌、糙皮侧耳)进行了比较。结果表明,在美味牛肝菌基因组中存在2 732个SSR位点,SSR间的平均距离为17.1kb。73.02%的SSR位点分布在基因组中的非编码区,并以单核苷酸和三核苷酸重复类型为主。分布于5?或3?非编译区的SSR的相对丰度最高,为86个/Mb,而分布于编码序列的SSR相对丰度最低,为31个/Mb。同时,高通量筛选出41个长SSR位点设计引物并通过e-PCR进行了验证。最后通过与其他3种担子菌基因组相比,发现SSR数量与基因组大小无关,SSR类型都以短重复类型(单核苷酸至三核苷酸)为主,比较发现美味牛肝菌基因组中的SSR位点数量相对较多,密度也较高。     

基于丹霞梧桐转录组数据的EST-SSR标记开发

以丹霞梧桐转录组序列为基础,开发丹霞梧桐EST-SSR标记位点,并利用其对丹霞梧桐群体进行遗传多样性分析,评价丹霞梧桐群体的遗传多样性水平,为丹霞梧桐的合理利用和保护提供依据。应用Primer 3.0、Gen Al Ex6.3、FSTAT和MS-tools等软件进行引物设计和相关遗传参数分析。17858个SSR位点分布于79920个unigene序列,SSR位点密度为1/4.78 kb。SSR重复基序中,三核苷酸(43.64%)为优势核苷酸,其次为四核苷酸(23.52%)和二核苷酸(15.54%)。三核苷酸和二核苷酸优势重复基序分别为AAG/CTT和AG/CT。以16个样本为材料,从设计的73对引物中共筛选出16对多态性EST-SSR引物,多态性信息含量(PIC)的平均值为0.546,所开发位点具有较高的多态性。主成分分析(PCA)表明,这些位点具有很好地鉴别不同地区样本,甚至单株的能力。3个群体的遗传多样性参数对比结果表明,丹霞梧桐群体具有中等程度的遗传多样性,其期望杂合度(He)的变化范围为0.550～0.605。地质、历史气候变化及人为干扰等因素可能是造成丹霞梧桐群体偏离哈代-温伯格平衡的主要原因。本研究所开发的EST-SSR多态性位点可为丹霞梧桐遗传结构分析和分子辅助育种等相关研究奠定良好基础。     

思茅松转录组SSR分析及标记开发

基于思茅松转录组测序数据进行其SSR标记开发,为丰富思茅松SSR数据库提供参考。采用MISA软件对思茅松59 636条Unigene进行SSR搜索,共获得3 745个SSR位点,分布频率为6.28%,平均11.36 kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以三核苷酸基序为主,其次是二核苷酸基序,所占比例分别为49%和24%,其主要重复单元分别为AGC/CTG和AT/TA。随机挑选224个位点进行引物设计及合成,琼脂糖凝胶检测发现其中29个位点具有多态性且效果良好,但仅12个位点符合SSR重复类型的倍数大小且扩增效率高于85%。利用这12对荧光标记引物,对2个居群42份样本进行遗传多样性分析,共检测到35个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.093 2-0.480 9,平均为0.306 9。4个位点为低度多态位点(0PIC0.25),8个位点为中度多态位点(0.25PIC0.5)。这12个标记可用于思茅松遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及克隆等研究,旨为思茅松分子标记辅助育种及变异水平等研究提供技术支持。     

3种烟草基因组SSR位点信息分析和标记开发

利用生物信息学方法对绒毛状烟草、林烟草和本塞姆氏烟草3份烟草野生种基因组数据中的SSR位点信息进行了分析。结果表明,在全长分别为2.14Gb、2.44Gb和2.59Gb的绒毛状烟草、林烟草和本塞姆氏烟草基因组中分别获得153 357个、196 493个和278 784个SSR位点,平均相隔13.94kb、12.42kb和9.31kb出现一个SSR。在SSR位点分布区域上,绝大部分的SSR位点分布在内含子和UTR(尤其是5′-UTR)区域;在SSR基序类型上,主要集中在二、三碱基基序且二者占总SSR位点数目的80%以上,并以二碱基基序类型丰度最高;在SSR基序结构上,基因组中出现频率及数量最高的是含有A(T)n的基序结构;在SSR基序的重复次数上,除单碱基基序类型外,重复次数多在3~10次之间。利用分别属于5个不同烟草组的8份烟草材料验证所合成的300对引物,所有合成的引物均能扩增获得目标片段,其中有80对引物存在扩增多态性。表明来源于绒毛状烟草、林烟草和本塞姆氏烟草基因组的SSR标记在亲缘关系相对较近的烟草种间具有高度保守性和通用性,基于此3份烟草野生种基因组数据开发SSR引物用于后续的相关遗传研究具有可行性。     

丝瓜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

对丝瓜(Luffa cylindrica)开展转录组测序分析,共获得58 073条unigene(序列总长约52 087 451 bp),共检测到8 693个SSR(simple sequence repeat)位点,平均分布距离为5.99 Kb;其中,SSR位点中主导类型为二核苷酸重复类型,占总SSR的45.89%;其次,三核苷酸重复类型,占38.89%。二核苷酸重复基序中以AG/CT为主,三核苷酸重复基序以AAG/CTT为主。通过Primer 3.0设计得到7 563对SSR引物,随机选择30对SSR引物,对32种不同来源的丝瓜进行多态性验证分析,其中,22对(占73.33%)引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将32份供试材料分为普通丝瓜和有棱丝瓜2类,这2类丝瓜可以进一步分别被分为2个亚群,丝瓜类群的划分与有无棱沟密切相关,与形状、颜色有较高的相关性。通过对丝瓜转录组分析可获得较高频率的SSR位点且类型丰富,为丝瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

烟草叶绿体基因组和线粒体基因组SSR位点分析

利用生物信息学方法对烟草叶绿体和线粒体基因组数据中的SSR信息进行了分析.结果表明,在叶绿体和线粒体基因组中分别获得186和578个SSR位点,SSR间的平均距离分别为838 bp和745 bp.在SSR的分布区域上,绝大多数SSR位点分布在UTR(尤其是5’UTR)区域;在SSR重复碱基类型上,主要集中在二、三碱基重复,二者占总SSR位点的90％以上,其中三碱基重复类型丰度最高.利用全部657对SSR引物在供试的10份烟草材料中进行扩增,发现所有引物均能获得目的片段,但在普通烟草内品种间并未检测到多态性,而在烟草种间有26对叶绿体基因组SSR引物和178对线粒体基因组SSR引物扩增出多态性条带,表明来源于烟草叶绿体基因组和线粒体基因组的SSR标记适合用于烟草种间进化、分类、遗传多样性等方面研究.     

芦笋EST资源的SSR信息分析

为了在芦笋中开发EST-SSR功能性标记,对来源于NCBI公共数据库的8590条芦笋(AsparagusofficinalisL.)EST序列进行简单重复序列SSR搜索。剔除冗余序列,得到非冗余序列8377条。在非冗余序列中共挖掘出469个EST-SSR,平均相隔14.80kb出现1个SSR。在所有的重复基序中,二核苷酸重复基序的SSR所占比例最高40.51%(190/469),其次是三核苷酸34.97%(164/469),六核苷酸21.11%(99/469)。在所有基序里,CT/AG出现的频率最高有62次,占全部重复基序的13.22%(62/469)。选取含SSR的EST序列30条,并利用primer5软件设计引物,进行SSR位点的扩增,其中27对引物扩增产物,24对有较清晰可靠的目标扩增条带,占引物数的80%,且所检测出的芦笋等位基因数量较丰富,平均4.93个/对。这些EST-SSR标记的开发将有助于芦笋群体遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位、分子标记和系谱分析等方面的研究。     

基于转录组数据的密花香薷SSR位点特征分析

利用MISA软件对密花香薷转录组42 362条Unigene进行SSR位点搜索,并对其SSR序列结构及分布特征进行了分析。结果表明:(1)密花香薷转录组Unigene序列中共检测到17 564个SSR重复序列,分布于11 903条Unigene上,出现频率为28.10%,平均每3 200 bp出现一个SSR位点。(2)单、二、三核苷酸重复类型为密花香薷转录组SSR位点的主导基序类型,占总SSR位点的97.27%,3种主导基序类型中,单核苷酸所形成基元类型数量最多,共检测到169个基元类型(51.22%),单核苷酸(A/T)n基元类型占明显优势,二核苷酸重复类型(AG/CT)n基元类型占优,分别占总SSR位点的50.60%和12.17%。(3)单核苷酸SSR位点所包含重复次数最多(49),重复次数介于10～66,同一基序类型不同重复次数所形成的SSR位点数量差异较大,随重复次数的增加,SSR位点数呈下降趋势。(4)密花香薷转录组二至六核苷酸基序SSR序列长度集中在12～30 bp区间,共包含有8 190个SSR位点,占所统计SSR位点的95.60%,1 589 (≥20 bp)个SSR序列具有极高的多态性,占所统计SSR位点的18.54%。综合出现频率、分布密度、基元重复次数和长度变异等多个研究结果发现,密花香薷转录组检索到的SSR序列表现出较高的多态性潜能,具有较大的开发价值。该研究为后续密花香薷SSR分子标记引物开发奠定了理论基础。     

山地虎耳草转录组SSR信息分析

利用MISA（MicroSatellite）软件对山地虎耳草转录组拼接序列进行微卫星位点信息分析,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测提供候选序列。结果发现,在拼接得到的63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00 kB出现一个SSR位点。山地虎耳草转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复（55.50%）,其次为二核苷酸重复（30.23%）。二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元分别为AG/TC和AAG/TTC。二核苷酸重复基元的重复次数类型最多,跨度最大,具有更高的多态性,三核苷酸次之,而四、五、六核苷酸重复类型很少。山地虎耳草转录组SSR以5~9次重复为主,且SSR数量随着重复次数的增加逐渐减少,基序长度主要集中于12~30 bp,多态性均在中等以上。     

基于转录组测序的枫香EST-SSR引物开发及有效性评价

枫香是广西重要的乡土树种之一，具有较高的用材、观赏及药用价值。为验证枫香SSR引物的实际应用效果，该研究基于转录组测序技术，检测枫香SSR位点并设计引物，通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出具有较高多态性的枫香EST-SSR引物，并对1个枫香天然群体进行遗传多样性分析。结果表明：(1)共发掘到23 777个SSR位点，单核苷酸重复类型SSR位点占总位点比例最高(46.54%),在重复次数上5～12次之间的SSR位点占比最高(72.36%)。(2)共开发出262对SSR引物，有效扩增率为53.1%,最终筛选出扩增稳定、条带清晰的引物18对。(3)多态性检测结果显示所有位点均具有多态性，天然群体遗传多样性结果显示该天然群体中等位基因数量(Na)、有效等位基因数量(Ne)、Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)变化范围分别为2～4、1.112 8～2.609 6、0.208 9～1.112 7和0.275 9～1.000 0,平均值分别为2.333 3、1.957 4、0.708 5和0.722 6。综上认为，枫香中占优势的SSR位点重复类型和重复基序与其他物种基本相同，所开...     

椭圆叶花锚简化基因组的SSR信息分析及SSR引物开发

基于RAD-seq简化基因组测序技术获得椭圆叶花锚（Halenia ellipitica D.Don）简化基因组水平上的序列信息并开发SSR分子标记。利用SR search软件检测而得到双端各有至少100 bp的五种类型的SSR（二、三、四、五、六核苷酸）位点共6 201个,并成功设计其中3 865个SSR引物。在能成功设计引物的SSR位点中,三核苷酸SSR位点最多;重复序列长度包括17种（12~36 bp）;重复序列的基序共达316种,其中五核苷酸基序种类最多（91种）。从中挑选65对可对应五种SSR类型的引物,经梯度PCR检验后,利用椭圆叶花锚的4个居群32个个对可扩增的引物进行PCR和聚丙烯酰氨凝胶电泳检测,其中14对引物能在绝大多数个体中扩增,且13对具多态性。13个多态性位点的等位基因数量均值为5.462,多态性较高且不连锁（P<0.05）;其中10个位点在多数居群中偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01）且存在较高的纯合子数量（观测杂合度H_o均值0.226）;近交系数在-0.443~1,均值为0.656;基因流N_m为0.474。     

竹子叶绿体基因组SSR分子标记的开发及其应用

为探讨观赏竹叶片异质性的机理,根据麻竹(Dendrocalamus latiflorus)和绿竹(Bambusa oldhamii)叶绿体基因组序列开发SSR分子标记。结果表明,在麻竹和绿竹叶绿体基因组中分别存在87和86个SSR位点,其中三核苷酸重复类型最多,其次为单核苷酸重复类型。根据SSR位点设计21对引物,其中11对引物对6竹种能够扩增出稳定、清晰的条带,且具有多态性,引物有效率达到52.4%。聚类分析表明,6竹种可分为两大类群,与形态学分类结果基本一致。有4对引物在菲白竹(Pleioblastus fortunei)和白纹椎谷笹(Sasaella glabra f.albo-striata)的花叶中具有多态性,可作为区分观赏竹叶片异质性的分子标记。     

香蕉EST-SSRs标记的开发与应用

从NCBI搜索的2 282条香蕉EST中, 发掘出含有SSR的EST序列110条, 共有122个SSR位点, 检出率为5.3%。SSR位点可分为37种重复单元, 平均长度为20 bp, 其中二、三核苷酸重复单元的SSR占主导地位, 分别占总SSR的33.1%和47.6%。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型, 分别占二、三核苷酸重复类型的75.7%和36.0%; 其他重复类型所占比例均不足10%, 而四核苷酸重复类型最少, 为4.0%。设计的63对EST-SSRs引物中, 有41对EST-SSRs引物对巴西蕉基因组DNA能扩增出产物, 占总引物数的65.1%。应用进一步筛选出的重复性好、多态性高的19对引物对49个香蕉品种(系)进行PCR扩增。每对引物扩增的多态性带数目为4~12个, 平均7.58个; 引物多态信息量变化范围为0.3572~0.8744, 平均0.7324。在相似系数为0.63的水平可将49个品种聚为2个类群：一类为含B基因组香蕉品种; 另一类为不含B基因组的香蕉品种, 表明EST-SSR引物可以应用于香蕉品种资源分类的研究。     

华仁杏幼果转录组SSR信息分析及其分子标记开发

为了解华仁杏微卫星(SSR)分布规律,开发EST-SSR引物,为华仁杏种质资源评价与辅助育种提供有效的鉴定标记。本研究采用生物信息学方法对华仁杏幼果转录组SSR位点的数量、频率、分布特征进行了统计分析;利用转录组数据进行了SSR引物的筛选和开发,并利用开发出的引物对华仁杏29个无性系进行了多态位点检测和鉴定。结果表明:华仁杏幼果EST-SSR的分布频率为19.21%,重复单元的重复次数分布在5~24次之间,优势重复基序为单核苷酸、2核苷酸、3核苷酸,分别占总SSR的19.81%、46.47%、32.49%。参试的139对引物中有39对引物可扩增出目标序列,其中24对引物可检测出多态性位点,占参试引物总数的17.27%。24对引物在29个华仁杏无性系中共检测出了170个等位基因位点,多态性信息含量(PIC)介于0.33~0.87之间,平均为0.64,其中高多态性引物19条,占多态性引物比例的79.2%。本研究对华仁杏转录组SSR信息进行了分析,并开发出了19对高多态性SSR引物,5对中多态性引物,为华仁杏种质资源评价及分子标记辅助育种提供了基础。     

基于转录组测序的葛根SSR标记研究与利用

该研究以‘桂粉葛1号’为材料，通过转录组测序的方法测得8.9 Gb clean reads，组装成137 629个转录本，最终得到83 811个Unigene序列。进化树分析表明，葛根和苜蓿、花生聚为一支。用MISA软件在83 811个序列中检测到25 452个简单重复序列(SSR)位点，三核苷酸重复的SSR数量最多，其次是二核苷酸重复。三核苷酸重复中，(AAG)_n是最普遍的重复单元(27.87%)。共设计了229对SSR引物，其中28对引物可以产生清晰的条带和丰富的多态性，被用于检测44份葛根资源的遗传多样性。在44个葛根资源的基因组DNA中共扩增出90个片段，其中89个条带有多态性，平均等位基因数为3.178 6。多态性信息量范围为0.083 0~0.774 2(平均数为0.455 7)。聚类分析显示遗传相似性系数范围为0.266 7~1.000 0。这些结果提示所检测的葛根资源在DNA分子水平存在着丰富的遗传多样性。当阈值为0.58时，44个资源可以划分为2个类群，且44份资源的类群划分与地理来源之间没有直接关系，但这些标记将是葛根遗传多样性研究可用的基因组资源。     

基于转录组的白沙蒿SSR分子标记的开发

[目的]利用转录组数据开发白沙蒿的SSR分子标记,探索其分布特点并对SSR引物进行有效性检测。[方法]以9个不同样品白沙蒿转录组数据为基础,利用MISA软件对1kb以上的Unigenes进行筛选;把重复序列单元相同、重复次数存在差异、侧翼序列长度完全相同的SSR位点作为引物合成的标准,采用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其有效性进行初步验证。[结果]在20 149条Unigenes中共检测出5 692个SSR位点,发生频率为22.95%,平均每隔6.66 kb出现1个位点。优势重复单元单、三、二核苷酸分别占总SSR位点的52.09%、28.30%和17.38%。经过验证筛选出具有多态性且扩增条带清晰的引物18对。[结论]印证了利用白沙蒿转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,且开发的有效SSR引物可用于后续群体的相关研究中。