哺乳类肝脏中胚层诱导物质的研究——Ⅲ.诱导物质量的差别和中胚层构造分化的关系

1.用不同浓度的肝脏中胚层诱导物质处理蝾螈早期原肠胚外胚层,研究诱导物质对中胚层分化的量的效应。同一批诱导蛋白质样品倍比稀释成每毫升含600微克、300微克、150微克、75微克和37.5微克共五个不同的浓度,用浸泡法处理外胚层,处理的时间是12小时。 2.随中胚层诱导物质浓度的增加,诱导强度和背方中胚层构造(脊索、肌肉)的诱导频率逐渐增加,而侧、腹方构造(前肾、血细胞)逐渐减少,呈现出明显的从腹、侧方到背方转变的趋势。这一结果支持中胚层诱导物质作用量的差别引起不同性质的中胚层分化的假定;并提示外胚层分化成位于背腹轴不同位置的中胚层构造需要接受不同阈值的诱导刺激。     

大鼠骨髓基质细胞向Schwann细胞分化后蛋白表达变化的研究

近年来很多研究报道大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,MSCs）可以向神经细胞或神经胶质细胞分化,其中多数研究观察了细胞形态以及几种神经相关蛋白的免疫反应,也有报道用基因组学方法分析MSCs诱导过程中基因谱的表达变化.尚未见报道用蛋白质组学方法分析MSCs在诱导过程中蛋白谱的表达变化.本研究利用蛋白质组学技术分析MSCs向Schwann细胞样细胞诱导分化过程中蛋白谱的表达变化.从成年SD大鼠的股骨和胫骨中分离培养MSCs,应用复合诱导因子体外连续诱导MSCs向Schwann细胞样细胞分化.采用2-DE技术分离未诱导和诱导分化后MSCs总蛋白,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图谱,搜索数据库分析差异蛋白质点.所得到的MSCs蛋白谱有792个蛋白点,通过PDQuest软件分析诱导前后MSCs的蛋白谱,初步分析发现有74个蛋白质的表达发生了明显的变化,其中43个蛋白表达上调,31个蛋白表达下调.本研究通过质谱分析并进行网上数据库搜索匹配,初步分析发现这些蛋白主要包括骨架和结构蛋白、生长因子类的蛋白、代谢相关蛋白及酶类、伴侣蛋白、受体类蛋白、细胞周期蛋白、钙结合蛋白以及其他蛋白等.研究表明,MSCs体外条件诱导分化过程中有较多蛋白表达发生变化;其中与神经细胞和神经胶质细胞相关蛋白：BDNF,CNTF,GFAP等在MSCs体外条件诱导分化后中表达明显上调;本研究从蛋白质水平为MSCs体外向Schwann细胞样细胞条件诱导提供了新的研究资料。     

维生素A酸诱导小鼠F9-1胚胎性癌细胞分化过程中蛋白质的变化

本文报道了用双向凝胶电泳和彩色银染技术,分析小鼠F9-1胚胎性癌细胞在维生素A酸诱导分化过程中蛋白质的变化。发现维生素A酸处理细胞72小时后,全细胞蛋白质中有9种蛋白质消失,而新出现11种蛋白质。对细胞核蛋白质进行了双向电泳分析,观察到诱导分化后新出现8种蛋白质,其中有一些与全细胞蛋白质图谱上出现的变化完全对应。对核内低迁移率非组蛋白的分析发现,经维生素A酸处理后,一些低迁移率非组蛋白消失。蛋白质的这些变化可能与维生素A酸诱导细胞分化过程中基因活性的变化有关。     

东方蝾螈早期原肠胚外胚层细胞的细胞周期与反应能力——Ⅰ.外胚层细胞的细胞周期和细胞同步化

在胚胎诱导的研究中,不少工作证明,外胚层细胞经同一种诱导物质处理,细胞能否接受诱导刺激,反应的强度如何,以及分化出哪些组织,是取决于外胚层细胞的年龄。受到中胚层诱导物质的刺激,早期原肠胚外胚层反应较强,分化出脊索、肌肉等构造,晚期原肠胚外胚层反应变弱,只能分化出血球、间质细胞等。其所以有这种差别,一般地都笼统地归之     

~(125)Ⅰ-中胚层诱导蛋白在东方蝾螈外胚层细胞内的定位

用放射自显影方法观察了外胚层细胞经~(125)Ⅰ-中胚层诱导蛋白处理不同时间的参入部位。随处理时间的不同~(125)Ⅰ-中胚层诱导蛋白的参入量和参入部位有所变化。处理1小时,约51%的外胚层细胞内出现标记蛋白,银颗粒多在细胞质内。处理3小时,标记细胞总数增至74%,而其中45%在核内观察到标记蛋白,每个核内平均为10个银颗粒。处理12小时,90%的反应细胞核内参入了标记蛋白,参入量增加为每个核内平均为21个银颗粒。实验结果表明,~(125)Ⅰ-中胚层诱导蛋白先是进入细胞质,然后转入细胞核。这似乎提示,中胚层诱导蛋白是在细胞核内行使其生理功能。     

两种绣线菊低温锻炼与脱锻炼处理对蛋白质表达的影响

通过2维双向电泳法,研究抗寒能力与光合能力不同的金山绣线菊与华北绣线菊,低温锻炼处理对蛋白质表达所产生的影响。结果表明,低温锻炼处理对2种绣线菊蛋白质表达的影响显著不同,在低温锻炼与脱锻炼处理中,金山绣线菊产生低温诱导特异蛋白,华北绣线菊没有低温诱导特异蛋白表达;蛋白质双向电泳图谱分析表明,华北绣线菊与金山绣线菊经过低温锻炼后发生蛋白质差异表达,经质谱鉴定其中的3种显著差异表达的蛋白质分别为2种未知新蛋白,2种未知蛋白的部分氨基酸序列分别为VSHLAGFSSNNPK、LKADKPTLLSEAK;DPNDHPNPFTVK、DGNGFFLYLLDPDSSK、NGDGMFLYLLDGLESK,另一种差异蛋白为抗坏血酸过氧化物酶;低温锻炼处理使绣线菊中与光合作用密切相关的蛋白质抗坏血酸过氧化物酶发生了显著的变化。     

两栖类早期发育中一内胚层形成和神经板发育之垂直的和平面的诱导作用

中-内胚层诱导和神经诱导都需要平面的和垂直的诱导相互作用;中胚层诱导开初是一个平面诱导过程,继之以一个垂直诱导,以实现最终的区域分化,而神经诱导则必须有最初的垂直相互作用,以实现激发和转化过程。这些垂直的诱导作用,继之以在外胚层内传播的同源诱导作用,决定神经板的形状和大小,以及其区域分化。对于神经板的背面集中和伸长,激发作用和后来的转化作用似乎都是必需的。     

东方蝾螈早期原肠胚外胚层细胞的细胞周期与反应能力——Ⅱ.阻断细胞周期后的反应能力

两栖类早期原肠胚外胚层细胞具有广泛的潜能,经不同的诱导刺激能向不同的方向分化,例如经缺钙处理可分化成神经组织,而豚鼠骨髓抽提液则可诱导出中胚层组织。但是,不论是哪种情况,诱导作用的强弱程度,都取决于外胚层细胞在接受诱导时的反应能力。Holtfreter首先发现,外胚层对诱导作用的反应能力随年龄不同而有改变。用轻度细胞解体的方法,庄孝僡证明,     

两栖类早期发育中—内胚层形成和神经板发育之垂直的平面的诱导作用

中－内胚层诱导和神经诱导都需要平面的垂直的诱导相互作用；中胚层诱导开初是一平面诱导过程，继之一个垂直诱导，以实最终的区域分化，而神经诱导则必须有最初垂直相互作用，以实现激发和转化过程，这些垂直的诱导作用，继之以在外胚层内传播的同源诱导作用，决定神经板的形状和大小，以及其区域分化。对于神经板的背面集中和伸长，激发作用和后来的转化作用似乎都是必需的。     

水稻胚胎发育时期的特异性蛋白质

对不同发育时期的水稻胚蛋白质,进行了单向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳分析。单向电泳图中存在20kD左右、胚分化完成期以后特有的蛋白质。根据双向电泳图谱,稻胚总蛋白按其在胚胎发育过程中的动态可分为7类,其中组成性的蛋白质约占85％,在不同发育时期基本不变;具有发育时期特异性的蛋白质约占15％。以分化期胚蛋白质的抗体,对各时期的胚蛋白质进行交叉免疫电泳,所得图谱总体上是相似的,但不同时期的图谱之间出现沉淀峰的峰形、位置和数目的差异。交叉免疫电泳图谱的这种变化可能反映了稻胚发育过程中某些分化期蛋白质发生的变化。     

东方蝾螈(Cynops orientalis)胚胎不同发育时期染色体DNA的甲基化

我们采用抗5-甲基胞嘧啶间接免疫过氧化物酶染色法,研究东方蝾螈原肠胚外胚层经诱导后,以及诱导后继续培养到相当于尾芽期细胞的染色体DNA的甲基化程度。148个早期原肠胚外胚层(对照组)、125个经中胚层诱导——豚鼠骨髓抽提液(3000微克/毫升)——处理过的外胚层,以及86个剥离的神经板细胞的染色体上,5-甲基胞嘧啶含量很低,染色体的着色情况如图版I,图1、2、3所示,主要在染色体周围着色。然而将未处理过的136个原肠胚外胚层,74个经诱导分化为中胚层构造的外植块以及104个分化为神经组织的外植块,继续在Holtfreter液中培养到相当于尾芽期,染色体上5-甲基胞嘧啶含量显著增加。抗5-甲基胞嘧啶间接免疫过氧化物酶染色明显加深(图版I,图4、5、6),且着色有一定的区域性分布,在着丝粒两侧和端粒处出现深着色,其分布特征与成体细胞——肠上皮细胞颇为相似;但与早期胚胎细胞的着色显然不同。对于酶染色不同的原因进行了讨论。     

小麦幼穗蛋白质双向电泳条件的优化

本研究以温光敏小麦为试材,用TCA/丙酮和酚提取法提取小麦幼穗蛋白样品,进行了双向电泳优化分析,并对双向电泳过程中出现的问题进行了讨论。结果表明,用TCA/丙酮法提取小麦幼穗蛋白质其产率(浓度)高于酚提取法。SDS-PAGE电泳显示,用TCA/丙酮提取法提取的蛋白质能获得较清晰条带,分辨率较高,而酚提取法提取的蛋白质其条带模糊,分辨率低。对蛋白质纯化除盐可以提高分辨率,减少横竖纹,获得背景清晰的圆形蛋白点。通过ImageMasterTM 2D Platinum5.0软件分析凝胶图谱,结果显示纯化后可降低噪点,纯化后蛋白点数可从未纯化蛋白点数的216增加到583。显然,采用TCA/丙酮法可获得高浓度高质量的蛋白质,而进一步纯化、除盐离子可进一步获得背景清晰可高重复性的电泳图谱。在双向电泳实验过程中,观察到一些异常缺陷胶的出现,如双向电泳图谱中蛋白点扩散,蛋白聚集形成斑点串,没有点或点很少,出现纵纹横纹及图谱扭曲等影响图谱质量的严重问题,本研究对这些问题做了分析并提出了解决方案。     

粘虫中肠总蛋白质双向电泳体系的优化方法

为了今后更好的利用双向电泳技术研究不同处理后粘虫Mythimna separata中肠蛋白表达差异,本研究比较了不同的蛋白提取方法、IPG胶条、二硫苏糖醇(DTT)浓度和等电聚焦条件,建立了适用于粘虫中肠总蛋白质的双向电泳体系。结果表明:采用Tris-饱和酚法提取蛋白质,选取p H为5-8的线性IPG胶条进行第一向等电点分离,按照DTT浓度I和等电聚焦程序II进行双向电泳分离,获得了蛋白质点数多、背景清晰、分辨率高的蛋白质双向电泳图谱。     

东方蝾螈早期发育过程中细胞核超微结构的观察

东方蝾螈胚胎发育过程中,从原肠早期到原肠末期无论外胚层或中胚层细胞核内都含有大量的异染色质团块,而到神经板形成后所有细胞核内染色质均呈分散状态。异染色质向常染色质的转变过程发生在原肠末期到神经板形成这段时间里,在原口闭合后4.5小时之前完成,此时期似乎是形态发生的转折点。到发育的后期,细胞核内有一些染色质又会由分散状态转变为凝聚的异染色质团块。预定神经上皮向神经组织分化的决定是个逐渐的过程,这一过程在原肠口闭合时已经开始,到神经板期完成。染色质的分散似乎发生在细胞有了初步决定之后。本文就染色质超微结构变化的意义以及染色质超微结构变化与细胞分化的关系等问题进行了讨论。     

口虾蛄性腺组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

旨在通过口虾蛄雄性、雌性性腺组织蛋白质双向电泳技术体系的优化,获得雄性、雌性口虾蛄性腺蛋白质的表达图谱。结果表明,不同的蛋白提取方法,上样前处理方法,上样量,聚焦时间及雌、雄性口虾蛄性腺蛋白表达图谱存在一定的差异。雌性、雄性口虾蛄用Tris-HCl提取后用丙酮沉淀方法提取蛋白质、不经上样缓冲液处理、上样量为10μg时,得到较好图谱。对图谱分析发现在pH4-6.5范围内,雌性口虾蛄性腺可溶性蛋白质种类多于雄性。雄性口虾蛄蛋白质点相对于雌性较少,且蛋白质大部分分布于酸性端。经过蛋白质双向电泳体系的优化,能显著提高双向电泳图谱的分辨率,为进一步研究口虾蛄性别差异表达蛋白的筛选,后续的口虾蛄蛋白质组学研究提供技术保障。     

脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1表达的研究

目的探讨脊髓源神经干细胞在诱导分化为胆碱能神经元过程中Aldoc和Stmn1的表达变化情况。方法从孕17天Wistar胚胎大鼠取出脊髓组织,制成细胞悬液,采用含EGF和bFGF的无血清限定性培养基培养,然后进行诱导分化,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,应用荧光定量PCR方法分析Aldoc和Stmn1基因在脊髓源神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的过程中的表达变化情况。结果神经干细胞在诱导分化为胆碱能神经元后,经免疫荧光检测有ChAT阳性细胞表达;Aldoc基因的表达量在胆碱能神经元较神经干细胞低(P<0.05);Stmn1基因的表达量则在诱导分化后较神经干细胞升高(P<0.05)。结论 Aldoc对神经干细胞的干性维持有重要作用,Stmn1在胆碱能神经元的成熟过程中起作用。     

外胚层细胞诱导后的间隙连接

用电镜观察了经受诱导作用之后胚胎细胞的冷冻蚀刻复型膜。和未经诱导作用的对照组比较,早期和中期神经胚的神经上皮细胞以及经过豚鼠骨髓粗提液(BME)——一种有效的异源中胚层诱导物——处理过的早期原肠胚外胚层,它们的间隙连接都处于活跃的动态状态。用图像分析仪测得的间隙连接连接子的排列密度,指出经受过诱导作用的三组分别和未经受诱导作用的对照组比较,计算求出P值,神经上皮两组和对照组的差别为非常显著,BME处理过的细胞和对照组的差别为显著。结合对照组与诱导后胚胎细胞间隙连接连接子的变化讨论了它们在信息传递上可能起的作用。     

决定两栖类胚胎形体构造之控制因子

本文综述了自H.Spemann 发现“组织者”以来,初级胚胎诱导作用研究的历史进程。庄孝僡1940年的工作证明成体组织含有化学性质不同的诱导物质,被认为是一个里程碑。此后,50—70年代欧洲和日本等实验室的探索,在中胚层诱导物质研究方面取得较大的进展。1987年J.C.Smith 发现爪蟾细胞系分泌的专一的中胚层诱导因子为一种多肽生长因子(激活素activin),取得了重大的突破,不过是否为内源的中胚层诱导物质仍难以肯定。在反应组织方面,作者综述了外胚层年龄、反应细胞数量、剂量效应以及细胞间通讯和生长因子受体与反应能力的关系。同时还注意到有尾类和无尾类外胚层对缺钙,LiCl 处理的反应能力有差异。根据对Suramin 和XFD-1基因研究结果,作者假定爪蟾初级胚胎诱导作用包括一系列事件:对植物极发出的中胚层诱导信号,位于边缘区的细胞,因反应能力的差异而出现背腹方分化。背部中胚层(“Organizer”)在原肠早期,随着背唇区专一些凶(如gooscoid,XLM-1等含同源异形框的基因)的逐次表达而决定。原肠中期,更多的基因及其产物(包括神经诱导因子)被激活和产生,结果导致中枢神经系统的诱导和区域分化。     

双向电泳分析鸢尾绿白嵌合叶片的蛋白质

利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对鸢尾（Iris japonica)绿白嵌合叶片的蛋白质进行分离,并初步鉴定了蛋白质的相对分子量和等电点。每个电泳图谱共检测到400余个蛋白点,其中至少13个蛋白的表达变化明显;结果表明,嵌合叶片的绿色与白色叶组织具有明显不同的蛋白质双向电泳图谱。与数据库中拟南芥双向电泳图谱相比较,发现Rubisco大亚基,标记为W和T蛋白的表达变化与产生绿白嵌合叶片的表型密切相关。     

胃癌细胞高尔基体的蛋白质组学技术平台的建立

采用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳（2-DE）分离高尔基体蛋白质,用ImageMaster 2D软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。结果显示分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,运用质谱技术鉴定出12个蛋白质,包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白、细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化,双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析,首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线,为胃癌细胞内高尔基体功能的深入研究奠定了基础。