几种肿瘤细胞中ezrin基因增强子区转录调控特性的研究

该文采用Western blot技术检测人食管癌EC109细胞、鼻咽癌CNE2细胞和宫颈癌HeLa细胞Ezrin蛋白的表达：采用DNA片段定向克隆技术构建一系列携带ezrin基因增强子区-1541／-706序列的报告基因表达载体,将载体瞬时转染EC109、CNE2和HeLa细胞,检测荧光素酶活性;研究肿瘤细胞中ezrin基因增强子区的转录调控特性。实验结果显示,在被检测的三种肿瘤细胞中,Ezfin蛋白的表达水平没有明显不同。Ec109细胞中,当ezrin基因-1541／-706N段正向位于无启动子的报告基因上游时,表现出类似启动子的转录激活作用：当这一片段反向连接时转录激活作用几乎消失。当-1541／-706片段正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著增强荧光素酶表达;然而,当这一片段反向位于启动子上游以及正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。ezrin基因-1541／-706N段在CNE2和HeLa细胞中的转录调控作用,与其在EC109细胞中的转录调控作用部分相似,但不完全相同。结果表明,ezrin基因增强子区具有转录激活和转录增强双重作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性以及细胞特异性。     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

用于化学预防剂筛选的转基因细胞模型的建立

建立TK启动子以及抗氧化反应元件(ARE)增强子调控报告基因GFP在HepG2细胞中稳定表达的细胞模型。人工合成ARE增强子序列,经退火和磷酸化后插入pTK-GFP载体的TK启动子上游,构建pARE-TK-GFP重组质粒。PCR法扩增TK和ARE-TK目的片段克隆到pEGFP-N1上,构建TK启动子启动以及上游由ARE增强子调控的报告基因表达载体pTK-GFP/Neo和pARE-TK-GFP/Neo。脂质体转染法转染人HepG2肝癌细胞后加G418筛选出阳性克隆。经扩大培养的克隆细胞中加入化学预防剂PDTC和香菇多糖作用48h后检测细胞中GFP荧光强度,结果显示pARE-TK-GFP/Neo表达载体中的GFP基因受ARE增强子的调控,其表达水平高于对照载体且在一定范围内与化学预防剂的浓度呈剂量效应关系,从而表明所构建的细胞模型可用于各种天然或人工合成的化学预防剂的初步筛选。     

两种AFP阳性肝癌细胞专一基因表达调控序列的构建

构建了由人胰蛋白酶抑制基因的增强子和大鼠ａｆｐ基因启动子与沉默子组成的杂合基因表达调控序列;还构建了１．２ｋｂ的由大鼠ａｆｐ基因增强Ⅲ和ｒＰＳ组成的调控序列。将报告基因－氯霉素乙酰转移酶基因置于这些序列控制之下,构建成ＣＡＴ表达载体ＡＴｒＰＳ－ｐＣＡＴ和ｒＡＦＰ－ｐＣＡＴ。     

用于靶向于NFAT的免疫抑制类小分子化合物筛选的细胞模型的建立

建立IL-2启动子以及NFAT-AP1增强子调控报告基因包括D2egfp或Luciferase在Jurkat细胞中瞬时表达的细胞模型。首先,利用三步连接将IL-2-promoter -255～+285处的序列插入到Pnf-Κb-D2egfp表达载体启动子上游,形成3个拷贝的前后串联的增强子序列;然后从人外周血钓取两条IL-2-promoter序列,包括-326～＋46以及-89～＋46两段基因组序列,分别替代上述重组表达载体中的TK minimal promoter, 构建所需的IL2 promoter以及NFAT-AP1 enhancer调控的报告基因表达质粒：3×NFAT-AP1-IL-2P/D2egfp和3×NFAT-AP1-TATA/D2egfp; 最后,分别将3×NFAT-AP1-IL-2P以及3×NFAT-AP1-TATA融合基因克隆到Pgl3-basic载体中,构建相应的Luciferase报告基因表达质粒。利用电转染方法将重组的报告基因表达载体瞬时转入Jurkat细胞后发现,未刺激以及PMA、离子霉素（Ionomycin）单刺激均不能激活下游报告基因的表达,只有PMA和离子霉素联合刺激才能启动D2egfp以及Luciferase的转录表达,并且5μg/Ml FK506预先作用1h能几乎完全阻断刺激剂诱导的无论是IL-2 promoter还是NFAT-AP1enhancer调控的报告基因的表达。实验结果提示,所构建的Jurkat细胞瞬时表达模型可用于靶向于NFAT信号通路的FK506类免疫抑制小分子化合物的初步筛选。     

染色质调节元件与不同启动子的相互作用对基因表达调控的影响

为探究DNA序列元件对不同启动子调节转基因稳定表达的影响,利用遍在染色质开放元件 (Ubiquitous chromatin opening elements,UCOE) 和基质黏附序列 (Scaffold/matrix-attachment regions,MAR) 分别与含增强子的oct4基因启动子、含CpG岛的sox2基因启动子和不含调控元件的nanog基因启动子以及同时包含增强子和CpG岛的CMV启动子组合构建pOCT4-MAR、pOCT4-UCOE、pSOX2-MAR、pSOX2-UCOE、pNANOG-MAR、pNANOG-UCOE、pCMV-UCOE、pCMV-MAR等质粒,分析这些质粒稳定转染后的表达量和嵌合表达差异。结果发现,UCOE与含增强子元件的oct4启动子组合能较稳定高效表达,而MAR与含CpG岛的sox2启动子组合能较稳定高效表达。利用排除位置效应原因的嵌合表达对染色质高级结构调控基因表达的稳定性分析表明：(1) 通常情况下UCOE比MAR调节的表达载体的表达更高效和更稳定;UCOE连接含CpG岛的启动子形成开放染色质调节的高表达更稳定;(2) MAR与启动子上TATA盒或增强子可能通过染色质环产生高表达,但相对不稳定。结论：染色质调节元件UCOE和MAR与启动子调控元件之间能通过染色质开放状态或染色质环调控基因稳定表达。     

小鼠ALB启动子/增强子驱动HSV-tk 对肝脏细胞的杀伤效应

利用小鼠白蛋白(ALB)启动子／增强子及单纯疱疹病毒胸苷嘧啶激酶(HSV-tk)DNA构建了载体pLLTK,以研究该载体对肝脏细胞的特异性杀伤效应。首先,为了比较载体的肝脏细胞特异转录活性,以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因构建了载体pLE(仅含小鼠ALB启动子)、pLLE(含小鼠ALB启动子和上游增强子)和pLEL(含小鼠ALB启动子和下游增强子),分别转染到人肝细胞株Hep—G2与小鼠乳腺上皮细胞株HC-11,荧光显微镜与流式细胞术分析GFP的表达。然后将载体pLLTK转染到Hep-G2研究对细胞的杀伤效应。结果发现：小鼠ALB启动子／增强子能驱动GFP肝脏特异表达;HSV-tk在Hep-G2表达使细胞具有更昔洛韦(GCV)敏感性,在GCV作用7d后,MTT分析细胞的生存率,pLLTK转染细胞表现明显的细胞死亡(53％),而阴性对照组pcDNA3．1转染细胞没有明显变化(仅2％细胞死亡)。以上结果表明所有的载体具有肝脏细胞特异性,为利用该载体产生肝脏损伤的转基因小鼠提供了细胞水平的实验依据。     

MDR1基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立

目的通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析,为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法。方法从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y—box序列。将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3．Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8／VCR细胞中。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。利用MDRI基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响。结果通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y—box序列且没有出现碱基突变。在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5：5时,转染效率最高并具有最高的萤光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。结论MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功。该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDRI基因表达的机理,而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选。     

hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究

为了研究hhlim基因表达调控机制,对该基因5′上游－2 537 bp序列从5′端依次进行缺失后,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性.结果表明,在hhlim基因5′上游－2 537～－1 537 bp之间存在负调控元件,在－253～－157 bp之间含有增强子样序列.用含有增强子样序列的DNA片段做探针,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析(electrophoretic mopility shift assay, EMSA).分析的结果显示,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同.结果还发现内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达.提示hhlim基因转录起始点至－2 537 bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列,该基因的表达受ET-1和bFGF的调节.     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA—MB-231细胞中的表达

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—C1—PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位。方法：采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达载体,脂质体Lip2000介导转染MDA—MB-231细胞,real—time PCR和western—blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有PPAIh编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布。结论：成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA—MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核。     

玉米叶绿体表达载体的构建及AsRED基因原核表达

从玉米幼嫩叶片中提取玉米叶绿体基因DNA,通过PCR克隆出叶绿体同源重组片段trnA和trnI、叶绿体特异性启动子Prrn以及终止子psbA.构建玉米叶绿体表达载体pBAIRTARED,含有一个人工操纵子,其中,筛选标记基因aadA和红色荧光蛋白报告基因AsRED处于Prrn启动子和psbA终止子控制.将构建的载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,观测到重组细胞呈现红色,表明构建的载体可以用于玉米叶绿体转化以及表达报告基因.     

乳腺癌细胞中人血小板衍生生长因子受体β启动子的基础活性研究

目的:探讨低迁移表型的乳腺癌细胞MCF-7和高迁移表型的乳腺癌细胞MDA-MB-231中血小板衍生生长因子β启动子的基础活性及转录调控差异。方法:Real-Time PCR,Weastern blot等技术检测PDGFRβ在2株细胞中的转录和表达差异。双荧光报告系统检测PDGFRβ启动子各缺失突变片段在2株细胞中的活性,筛选差异片段。生物信息学预测启动子区可能存在的转录因子。凝胶迁移实验研究转录因子在两株乳腺癌细胞中对PDGFRβ启动子的调节活性。结果:两株细胞中都有PDGFRβ的内源性表达,且在MDA-MB-231中表达较高。在2株细胞中找到了人PDGFRB 启动子的重要活性调节区,(+539bp,+1457bp)在2株细胞中均呈负调控,(+54bp,+539bp)在两株细胞中均呈正调控,(-983bp,+54bp)在MDA-MB-231中呈显著正调控,在MCF-7中没有活性。转录因子AP1的转录活性和与DNA的结合活性在MDA-MB-231中均高于MCF-7。结论:不同迁移表型的乳腺癌细胞中PDGFRβ存在不同的表达调控机制,PDGFRβ启动子活性片段(-983bp,+54bp)在两株细胞中存在显著活性差异。转录因子AP-1在两株细胞中有表达水平和结合活性差异。     

乙型肝炎病毒蛋白和绿色荧光蛋白的共表达研究

目的：构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的乙型肝炎病毒（HBV）真核表达载体,并研究其在真核细胞和小鼠体内的共表达。方法：以质粒pBR322-HBVadr2．0和pCX-EGFP为基础,构建含有双拷贝HBV全基因组DNA和EGFP基因的真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,分别转染真核细胞和小鼠肝组织,建立体外、体内表达系统,研究GFP和HBV基因的表达。结果：构建了真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,EGFP和HBV病毒蛋白在体内和体外均可表达。结论：构建的pCX-EGFP-HBVadr2．0真核表达载体可以GFP作为HBV存在与否的报告基因,提高了培育检测转基因小鼠的效率,为转基因小鼠的制备及后续研究奠定了基础。     

靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真核转录载体pSilencer1．0-U6-FOXMI—shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量·聚合酶链反应（Real—timeqPCR）、蛋白免疫印迹法（Westemblot）分别检测FOXMl基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSileneerl．0-U6-FOXMl-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P〈0．05）,平板克隆形成显著减少（P〈0．05）,重组载体转染后显著抑制MDA—MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXMI基因对乳腺癌细胞株MDA—MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

A new technique for selective identification and mapping of enhancers within long genomic sequences

We report a new experimental method of direct selection, identification, and mapping of potential enhancer sequences within extended stretches of genomic DNA. The method allows simultaneous cloning of a quantity of sequences instead of tedious screening of the separate ones, thus providing a robust and high-throughput approach to the mapping of enhancers. The selection procedure is based on the ability of such sequences to activate a minimal promoter that drives expression of a selective gene. To this end a mixture of short DNA fragments derived from the segment of interest was cloned in a retroviral vector containing the neomycin phosphotransferase II gene under control of a cytomegalovirus (CMV) minimal promoter. The pool of retroviruses obtained was used to infect HeLa cells and then to select neomycin-resistant colonies containing constructs with enhancer-like sequences. The pool of the genomic fragments was rescued by PCR and cloned, forming a library of the potential enhancers. Fifteen enhancer-like fragments were selected from 1-Mb human genome locus, and enhancer activity of 13 of them was verified in a transient transfection reporter gene assay. The sequences selected were found to be predominantly located near 5' regions of genes or within gene introns.     

采用双荧光素酶报告法验证乳腺癌中miR-155靶标

MiR-155与乳腺癌发生发展密切相关. 本研究以乳腺癌组织和血清中均显著高表达的miR 155为研究对象,利用TargetScan和PicTar预测miR 155的靶基因. 根据miR 155与靶基因结合的保守性、动力学及靶基因功能,筛选出miR 155的靶基因ACTA1（actin alpha 1, skeletal muscle）和CEBPB（CCAAT/enhancer binding protein beta）,并用双荧光素酶报告法验证. 将ACTA1和CEBPB的3′-UTR（3′-untranslated region）全长序列载入海肾荧光素酶基因的下游,并构建结合位点的突变序列,得到pRL-TK-Aw、pRL-TK-Am、pRL-TK-Cw、pRL-TK-Cm载体.不同海肾荧光素酶载体转染Bcap37乳腺癌细胞,同时转染miR-155及内参对照萤火虫荧光素酶载体pGL3-control. 根据不同转染的海肾荧光素酶表达活性,运用SPSS软件分析,结果显示,CEBPB是miR-155在乳腺癌中的直接靶基因（P< 0.05）. miR-155通过下调CEBPB影响乳腺癌的发生.