金黄色葡萄球菌核酸酶A与不同外源DNA片段融合表达的作用比较

金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)可用于菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除。关于SNA在去除了信号肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞质中发挥作用尚存争议。为厘清这一争议,分别构建一系列含SNA、SNA与λ噬菌体cro基因或结核杆菌脲酶基因部分序列的融合片段c SNA或u SNA的温控质粒并对其在大肠杆菌内的作用进行评价。结果显示,SNA、c SNA和u SNA的表达产物对大肠杆菌的4 h灭活率分别为99.9%、99.8%和74.2%。升温诱导30 min后,SNA和c SNA即可在宿主菌胞内被检出,而u SNA需1 h;相较之下,SNA和c SNA在培养液上清中的被检出时间要晚1 h,u SNA则晚2 h。对三者的核酸酶活性检测均为:SNA﹥c SNA﹥u SNA,且胞外活性都显著低于胞内。此外,SNA和c SNA在诱导2 h后即将宿主基因组成功降解,而u SNA则在整个实验期间均未能使宿主基因组完全降解。这表明SNA、c SNA和u SNA的表达产物均具有核酸酶活性,可被动释放至胞外,外源DNA片段的融入反而会降低SNA的核酸酶活性。     

用于化学预防剂筛选的转基因细胞模型的建立

建立TK启动子以及抗氧化反应元件(ARE)增强子调控报告基因GFP在HepG2细胞中稳定表达的细胞模型。人工合成ARE增强子序列,经退火和磷酸化后插入pTK-GFP载体的TK启动子上游,构建pARE-TK-GFP重组质粒。PCR法扩增TK和ARE-TK目的片段克隆到pEGFP-N1上,构建TK启动子启动以及上游由ARE增强子调控的报告基因表达载体pTK-GFP/Neo和pARE-TK-GFP/Neo。脂质体转染法转染人HepG2肝癌细胞后加G418筛选出阳性克隆。经扩大培养的克隆细胞中加入化学预防剂PDTC和香菇多糖作用48h后检测细胞中GFP荧光强度,结果显示pARE-TK-GFP/Neo表达载体中的GFP基因受ARE增强子的调控,其表达水平高于对照载体且在一定范围内与化学预防剂的浓度呈剂量效应关系,从而表明所构建的细胞模型可用于各种天然或人工合成的化学预防剂的初步筛选。