肺炎链球菌分型方法的研究进展

肺炎链球菌疫苗仍是全球最急需的前3位疫苗之一,为保证一个最佳的肺炎链球菌多糖菌苗和(或)蛋白多糖结合菌苗复合物,很有必要对肺炎链球菌进行菌型监测.近年来,WHO及许多国家开展了肺炎链球菌的菌型监测,取得了较好的进展,其分型方法也在不断改进.     

老慢气患者下呼吸道微生态学的研究

为深入探讨老慢气的发病机理,运用微生态学原理对３２例老慢气患者下呼吸道以纤难支气管和环甲膜穿刺的方法采取气和必物标本,以进一步探讨老慢患者与菌群失调的关系。结果表明,老慢气患者下呼吸道需氧菌主要为肺炎链球菌、奈瑟菌、甲型链球菌。肺炎链球菌和奈瑟菌的检出率分别为５０％和４３．７５％。厌氧菌主要为消化链球菌、韦荣菌、优杆菌、丙酸力。消化链球菌检出率为８７．５％、韦荣菌为３４．３８％。药敏实验表明,肺炎     

经验放大法对肺炎链球菌规模化发酵工艺条件的研究

目的应用经验放大法探索肺炎链球菌规模化基本发酵工艺条件。方法复苏肺炎链球菌菌种,传代培养,最后接种于30 L发酵罐中,以细菌发酵的培养时间、收获液菌浓度A600 nm值、荚膜多糖产率为指标评价发酵工艺;以纯化多糖的功能基团含量、相对分子质量大小(色谱分配系数KD值)、生物活性为指标评价多糖质量。以4型、19F型肺炎链球菌为首选菌株,用于筛选高产菌株、优化传代方法、培养基及30 L发酵罐的通气条件,并应用经验放大法至270 L及1 200 L发酵罐,并将发酵条件推演到其他血清型肺炎链球菌。结果筛选出肺炎链球菌4型和19F高产菌株,利用市售复合培养基,经3代种子液体-液体传代法,0.03 VVM通气条件下,4型和19F菌株在3 0 L发酵罐中获得良好的培养结果;并采用经验放大法至1 200 L发酵罐,获得良好结果。采用此发酵工艺条件,其他20个血清型肺炎链球菌在1 200 L发酵罐中也获得较理想结果。结论应用经验放大法初步探索了肺炎链球菌在1 200 L发酵罐中的发酵工艺条件。     

肺炎链球菌荚膜多糖特异性IgG抗体定量ELISA检测及质量控制要求

检测肺炎链球菌荚膜多糖(PPS)特异性抗体的酶联免疫吸附试验多年来经历了两次主要改进。介绍了WHO推荐的人血清抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖抗体IgG定量ELISA(Pn PS ELISA)检测方法、关键试剂、局限性以及方法验证等内容。ELISA定量检测法,为预防肺炎链球菌的婴幼儿侵袭性疾病提供准确的抗体水平,并对肺炎链球菌疫苗的临床评价提供血清学证据。人血清中肺炎链球菌荚膜多糖抗体IgG是判断肺炎链球菌疫苗效力的重要指标。     

肺炎链球菌pbp2b和pbp1a基因突变与青霉素耐药的相关性研究

目的探讨耐青霉素肺炎链球菌pbp2b和pbp1 a基因的突变与青霉素耐药的关系,为明了肺炎链球菌的耐药性变异机制,防治其感染提供实验依据。方法从呼吸道感染患儿痰标本中分离肺炎链球菌163株,液体培养基连续稀释法测定其对青霉素的最小抑菌浓度(M IC),套式聚合酶链反应(nPCR)扩增pbp2b和pbp1 a基因,扩增产物直接DNA测序,所测序列与青霉素敏感株(SPN R6)的基因序列进行比较,并分析其氨基酸结构的改变。结果 163株肺炎链球菌中检出青霉素敏感菌75株,中度敏感17株,青霉素耐药菌71株(44%)。耐药菌中58株存在pbp2b突变(81.7%),其中,56株为点突变,2株为CCT插入突变;在27株有pbp2b基因突变的B型和C型耐药菌中,21株出现了不同程度的pbp1 a基因突变。PBP2B氨基酸结构改变以苏氨酸变为丙氨酸、精氨酸变为赖氨酸为主,PBP1A以丙氨酸变为苏氨酸、谷氨酸变为天门冬氨酸为主。结论肺炎链球菌的pbp2b和pbp1 a基因突变与对青霉素的耐药性密切相关,PBP2b突变导致低水平耐药;PBP2b和PBP1A突变导致高水平耐药。     

肺炎链球菌及其多糖菌苗

<正>一、一般情况 肺炎链球菌(Strep Pneuwmoniac)又名肺炎双球菌,为链球菌科的链球菌属中的一种。为1881年由巴斯德首先分离出,之后美国Stornberg也报导了。肺炎链球菌对成人主要引起大叶性肺炎,对婴幼儿引起中耳炎。它引起的肺炎是一种呼吸道常见的急性传染病,在化脓性脑脊髓膜炎的病原中,它也是首要的病原菌。在正常人的口腔及鼻咽腔内,此菌经常存在形成带菌状态。在机体抵抗力下降时引起疾病,尤其是老年人及免疫缺陷病人,脾切除及脾功能障碍的病人,对本菌的感受性更高。可能与患者体内补体替代途径中某种成分的缺陷有关。 肺炎链球菌为革兰氏阳性,有荚膜,矛头状的双球菌,常排成直的短链,在含血清的肉水中弥漫地散在生长。在血琼脂上的菌落呈光滑型,其周围有一狭窄溶血环?-hemolysis为相对厌氧菌。有些菌株从临床标本分离时需要二氧化碳,加热     

应用分子生物学方法鉴定6群肺炎链球菌血清型

目的利用分子生物学方法,鉴定26株6群肺炎链球菌的血清型。方法利用6群肺炎链球菌荚膜多糖相关基因设计合成6对特异性引物,PCR扩增26株肺炎链球菌,并对PCR产物进行基因序列的测定及分析。结果26株肺炎链球菌cpsD蛋白229个氨基酸中有7个突变点,第220~222位均没有缺失;其中,19株肺炎链球菌具有与wci Nα蛋白氨基酸序列完全一致的氨基酸组成,第150位均为Ala,第38位均为Asp,其余7株与wciN_α蛋白氨基酸序列没有相似性,但与wciN_β蛋白氨基酸序列相似性超过99%;15株wciP蛋白第195位为Ser,11株wci P蛋白第195位为Asn。综合分析比对后,26株6群肺炎链球菌中,11株属于6A型肺炎链球菌,8株属于6B型肺炎链球菌,4株属于6C型肺炎链球菌,3株属于6D型肺炎链球菌。结论分子生物学方法可用于6群肺炎链球菌血清型的鉴定,为完善6群肺炎链球菌的菌种档案提供了实验依据。     

11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,研究7株11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)。方法根据11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因设计合成5对特异性引物,以7株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定及基因序列比对,确定其血清型。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术分析7株11群肺炎链球菌序列型(ST)。采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和cps基因分别绘制系统发育树。结果根据wcw C、gct和wcj E等3个基因产物确定5株原11A型肺炎链球菌为11A型,无11E型;根据wcwR和gct等2个基因产物确定2株原11B型肺炎链球菌为11B型。获得7株不包括4个合成调控基因(wzg、wzh、wzd和wze)的11群肺炎链球菌cps loci,长度为11～12 kb,11A型具有12个开放式阅读框(ORF),11B型具有11个ORF。5株11A型肺炎链球菌部分cps基因序列差异较大; 2株11B型肺炎链球菌部分cps基因序列相似性高于99%。根据MLST分析发现3种新的ST型。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树和cps基因绘制的系统发育树差异很大。结论从分子水平上确定了11A和11B血清型。获得了5株11A型和2株11B型肺炎链球菌ST型和部分荚膜多糖合成相关基因(cps loci),完善了11群肺炎链球菌的菌种档案。     

肺炎链球菌转化模型的建立与优化

建立肺炎链球菌转化模型,优化转化体系,提高转化率,以便于进一步研究其致病的分子机制。制备肺炎链球菌感受态,首先在不同菌密度下转化外源DNA,计数抗生素筛选平板上的转化菌落,比较其转化率,确定转化的最适菌密度;然后在此菌密度下比较CSP诱导不同时相的转化率,同时用RT-PCR检测感受态调控基因comE的表达。对所用血清3型菌株而言转化的最适菌密度在OD550=0.09~0.10之间;CSP-2诱导10 min后转化率最高,可达(15.6±3)%;comE的表达也在CSP-2诱导10 min后达到最高。在实验室条件下,肺炎链球菌转化受多种因素的影响,必需控制好各种因素,选择最优条件才能获得稳定、高效的转化。     

应用whaF基因序列鉴定20型肺炎链球菌血清型

目的应用wha F基因测序方法,对20型肺炎链球菌进行血清型鉴定。方法采用血清凝集法和用20型肺炎链球菌型特异性基因(wci L基因)合成的引物进行PCR扩增,对中国医学细菌保藏管理中心所保藏的20型肺炎链球菌进行血清学鉴定;根据Gen Bank上发表的wha F基因设计合成引物,PCR扩增wha F基因,利用测序获得基因序列,分析wha F基因多态性。结果 7株20型肺炎链球菌菌株均能与20型血清产生血清凝集反应,wci L基因PCR扩增产物,可见与预期相符大小500 bp的特异性条带。wha F基因PCR扩增产物,除20-3外,其余6株菌均可见1 000bp大小与预期相符的PCR扩增产物。wha F基因测序和分析显示:20-2、20-4、20-5、20-7与20B亚型(Gen Bank accession No.:CR931679和JQ653093)的wha F基因序列相同;20-6与20A亚型(Gen Bank accession No.:JQ653094)的wha F基因序列相同;20-1与CR931679和JQ653093相比,在898有点突变(A→C)。20-3的wha F基因比20A亚型和20B亚型的wha F基因均少了约600 bp。结论 20-6为20A亚型肺炎链球菌,20-2、20-4、20-5、20-7均为20B亚型肺炎链球菌。     

肺炎链球菌粘附和毒力因子A研究进展

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,SP）普遍定植于呼吸道,是人类重要的侵袭性病原菌之一,是社区获得性肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症、鼻窦炎的主要病原菌。肺炎链球菌粘附和毒力因子A（pneumococcal adherence and virulence factor A,PavA）是肺炎链球菌早期感染和侵袭过程中关键的毒力因子。体外试验表明,缺失PavA的肺炎链球菌的突变株其粘附和侵入上皮细胞和内皮细胞的能力明显下降。作为一种保护性抗原,其诱导的细胞和体液免疫可以有效的抵抗肺炎链球菌的感染,是肺炎链球菌新一代疫苗的候选蛋白。但是,PavA在肺炎链球菌与人肺上皮细胞交互对话中作用机制的研究尚属空白,本文就肺炎链球菌粘附和毒力因子A得最新研究进展作一综述。     

肺炎链球菌二元信号转导系统研究进展

肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的主要病原菌。透彻地了解肺炎链球菌的信号转导对于系统地认识该菌的致病机制和靶标药物的设计具有重要意义。二元信号转导系统作为在病原菌中普遍存在的一种跨膜信号转导机制,在细菌响应外界环境变化并作出适应性反应的过程中起着主要作用。随着大规模基因组测序、信号标签诱变、差异荧光诱导以及DNA微阵列等技术的蓬勃发展,关于肺炎链球菌的二元信号转导系统已经取得了许多重要的研究成果。本文就肺炎链球菌二元信号转导系统的研究进展作一综述。     

中国肺炎链球菌标准菌株的筛选和建立

对我国自行分离的737株肺炎链球菌,依据生物学特性、地区分布及血清学分型进行筛选,选出297株具有典型特征的肺炎链球菌,建立了我国肺炎链球菌标准菌株。共分成42个群(型),其中有我国自行分离并保藏的二株国际上首次发现的新型10C和16A致病性肺炎链球菌,以及国际上多年来未见到的19C型、22A型和仅在亚洲分离到的33C型菌株。研究肺炎链球菌的血清学分型(群),建立标准分型菌株不仅有分类学的重要价值,而且对研究肺炎链球菌疾病的防冶具有重要意义。     

小儿细菌性肺炎痰培养物病原菌构成及耐药性分析

目的分析肺炎患儿痰培养物中细菌构成及其耐药情况,为小儿细菌性肺炎治疗提供合理使用抗感染药物的依据。方法对2019年11月至2020年12月济宁市第一人民医院临床送检的肺炎患儿痰液标本进行病原菌的分离鉴定和药敏试验,收集相关资料,并对小儿肺炎病原菌在临床上的分布特点及其耐药情况进一步分析。结果痰液培养阳性患儿183例,其中多重细菌感染患儿16例,共培养出199株细菌(剔除同一患儿的重复菌株),其中革兰阴性菌128株(64.32%),革兰阳性菌71株(35.68%)。主流细菌为肺炎链球菌(19.60%)、金黄色葡萄球菌(16.08%)、卡他莫拉菌(13.57%)、肺炎克雷伯菌(11.06%)和大肠埃希菌(10.05%)。多重细菌感染主要以金黄色葡萄球菌+肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌+大肠埃希菌混合为主(共5例,31.25%)。肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌对利奈唑胺、万古霉素绝对敏感。卡他莫拉菌对头孢噻肟、头孢曲松、米诺环素等绝对敏感。肠杆菌科中肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌药敏结果相似,对阿米卡星、厄他培南、头孢替坦敏感率在95%～100%,对氨苄西林耐药率在95%～100%。肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌对左氧氟沙星敏感率均大于90%,大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对左氧氟沙星不够敏感,但中敏率达到75%以上。结论肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌感染是本地肺炎患儿痰液中常见菌,抗生素耐药状况比较严重,亚胺培南对革兰阴性菌混合感染的效果较好,利奈唑胺对阳性菌效果较好;左氧氟沙星可用于革兰阴性和阳性菌混合感染,合理使用抗生素应注意针对性和用药时间,杀灭致病菌的同时尽可能维护正常菌群的平衡。     

肺炎链球菌LytR蛋白影响细菌生长和磷壁酸的合成

为了初步明确lytR基因的保守性以及探讨LytR蛋白在肺炎链球菌中的生物学功能。本研究利用PCR和测序方法分析lytR基因20种不同序列型肺炎链球菌临床分离株的保守性;利用Western blotting技术分析lytR在细菌不同生长阶段的表达情况;随后,利用红霉素片段替代lytR基因构建D39ΔlytR缺陷菌株,通过生长曲线分析、电镜下形态观察、以及磷壁酸含量测定揭示LytR蛋白在细菌生长、细菌形态以及磷壁酸合成中的作用。研究发现20种不同序列型肺炎链球菌临床菌株的lytR基因序列一致性99.3%;Western blotting结果显示lytR在细菌不同生长阶段稳定表达;D39ΔlytR缺陷株生长明显变缓,细菌表现为不成熟自溶;D39ΔlytR全菌磷壁酸含量显著减少,而培养基上清中的磷壁酸含量显著增多。本研究表明lytR基因非常保守,在肺炎链球菌不同生长阶段均有表达,并可能通过连接酶的作用影响细菌生长和参与肺炎链球菌磷壁酸的合成,有望成为一种新的抗生素和药物靶点。     

岩藻糖基化人乳低聚糖在新生儿无乳链球菌肺炎治疗中的作用

目的探讨岩藻糖基化人乳低聚糖在新生儿无乳链球菌肺炎中的治疗作用。方法收集本院2015年7月至2017年2月痰培养阳性新生儿无乳链球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染性肺炎病例,分析不同喂养方式、不同病原类别肺炎在住院时间、炎症、并发症等指标差异,探讨岩藻糖基化人乳低聚糖对无乳链球菌感染的独特治疗作用;使用含有不同浓度岩藻糖基化人乳低聚糖的培养基对无乳链球菌进行培养,研究岩藻糖基化人乳低聚糖抑制无乳链球菌的最佳浓度;分别使用岩藻糖基化人乳低聚糖或酸性人乳低聚糖加入培养基中对无乳链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌进行培养,进一步探讨岩藻糖基化人乳低聚糖对无乳链球菌的独特抑制作用。结果无乳链球菌肺炎患儿,母乳喂养组的住院时间较人工喂养组住院时间减少[(8.35±0.77)d vs(10.91±0.54)d,t=1.557 676,P<0.05)],PCT值较人工喂养组低[(2.38±0.63)ng/mL vs(8.69±2.23)ng/mL,t=1.419 964,P<0.05],白细胞计数较人工喂养组低[(13.28±1.08)×10^9/L vs(16.16±0.98)×10^9/L,t=1.878 447,P<0.05],脑膜炎发生率较人工喂养组低(5%vs 35%,χ^2=5.601 353,P<0.05),呼吸机使用率较人工喂养组低(10.0%vs 36.4%,χ^2=4.005 042,P<0.05);大肠埃希菌肺炎患儿、肺炎克雷伯菌肺炎患儿,母乳喂养组与人工喂养组比较,住院时间稍减少,PCT值、白细胞计数、脑膜炎发生率和呼吸机使用率均有所降低,差异无统计学意义;细菌培养实验发现岩藻糖基化人乳低聚糖在2.5 mg/L浓度的时候可以明显抑制无乳链球菌的生长,对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌无明显抑制作用,酸性人乳低聚糖对3种细菌均无抑制作用。结论岩藻糖基化人乳低聚糖可以明显抑制无乳链球菌的生长,可能成为未来无乳链球菌感染性肺炎治疗中新的靶点,值得深入研究。     

肺炎患者与健康人口咽部菌群分析

目的观察肺炎患者口咽部菌群分布情况,探讨肺炎患者与健康人群口咽部菌群分布差异。方法采集细菌性肺炎稳定期患者(29例)和健康人群(31例)咽拭子进行细菌培养,并对其咽部菌落进行计数和菌种鉴定。结果肺炎患者咽拭子培养中主要致病菌和条件致病菌检出种类和检出率较健康者明显增加,肺炎组与健康组相比需氧菌与厌氧菌的菌群密度具有上升趋势,使用t检验计算结果差异有统计学意义(P0.05)。在可培养的肺炎组人群口咽菌群中肺炎链球菌检出率最高,其次为微球菌、副溶血链球菌、甲型链球菌;在健康体检人群口咽部菌群中甲型链球菌检出率最高,其次为奇异变形杆菌、微杆菌属、轻型链球菌、颗粒链球菌。结论与健康对照组相比,肺炎患者口咽部菌群分布紊乱,且肺炎组患者呼吸道菌群数量明显增多。     

肺炎链球菌与宿主炎症小体的相互作用机制

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种定植于上呼吸道的革兰阳性胞外菌,是导致侵袭性肺炎的主要原因,所致疾病具有较高的发病率和死亡率。炎症小体(inflammasome)是胞浆内重要的蛋白复合体,在先天免疫应答过程中起着重要作用。大量研究表明,肺炎链球菌感染可诱导宿主炎症小体的激活、半胱天冬酶1的活化和促炎性细胞因子的分泌。在长期选择压力的作用下,肺炎链球菌的部分突变菌株可以逃避炎症小体的识别。本文就肺炎链球菌感染过程中炎症小体的激活、炎症小体在抗肺炎链球菌过程中的作用以及肺炎链球菌逃避宿主炎症小体识别的机制三方面对肺炎链球菌与炎症小体之间相互作用的研究进展进行综述。     

18～60岁健康人群肺炎链球菌IgG抗体水平调查

目的了解18~60岁健康人群肺炎链球菌IgG抗体水平,为肺炎链球菌性疾病的预防与控制提供参考依据。方法选取甘肃、宁夏健康献浆员为调查对象,分为18~30、31~40、41~50、51~60岁4个年龄组,共调查347人。采用WHO推荐的标准化酶联免疫吸附试验检测12种肺炎链球菌血清型IgG抗体水平,并计算IgG抗体阳性率和几何平均浓度(Geometric mean concentration,GMC)。结果质控血清QC907的IgG抗体浓度均值与参考值之间的误差百分数均未超过±40%,测定值符合其参考值范围,各血清型抗体浓度检测结果的CV均30%。347份血清样品肺炎链球菌IgG抗体总阳性率为64.8%~96.0%,GMC为0.37~2.24μg/m L。不同血清型间IgG抗体GMC差异具有统计学意义(P0.05)。不同年龄组同种血清型IgG抗体阳性率及GMC均无统计学意义(P0.05)。除19F型外,不同地区同种血清型IgG抗体阳性率均有统计学意义(P0.05);除4、7F、14和18C型外,不同地区同种血清型IgG抗体GMC间差异均有统计学意义(P0.05)。结论 18~60岁健康人群肺炎链球菌IgG抗体水平普遍较高,对肺炎链球菌主要流行血清型均具有一定的保护力。     

肺炎链球菌溶血素黏膜免疫抗定植保护作用的研究

目的原核表达△A146Ply蛋白,评价△A146Ply黏膜免疫对肺炎链球菌（Streptococcuspneumon—ioe,5．Pn）在宿主鼻咽部定植的保护作用。方法IPTG诱导、Ni—NTA树脂纯化获得纯化的△A146Ply蛋白,经黏膜免疫BALB／C小鼠,制备其特异性抗血清;进行体内抗定植实验,观察小鼠鼻咽部灌洗液和肺部残存的细菌数量,检测△A146Ply黏膜免疫对19F型肺炎链球菌在鼻咽部定植的保护作用。为验证该保护作用是否具有广谱性,培养血清型14型、3型、6型和2型S．pn,经鼻腔感染免疫后小鼠,评价△A146Ply蛋白黏膜免疫对多株肺炎链球菌定植的保护作用。进行体外抗黏附实验,检测△A146Ply蛋白及其抗血清是否对无荚膜的肺炎链球菌R6黏附A549细胞具有抑制作用。结果获得了纯度〉90％的目的蛋白;体内实验结果显示,△A146Ply黏膜免疫可以显著降低肺炎链球菌19F在宿主鼻咽部和肺部残存的细菌数量（P〈0．01）;14型和3型肺炎链球菌在免疫后小鼠鼻咽部及肺部定植的数量均显著下降（P〈0．05）,2型肺炎链球菌在免疫后小鼠肺部定植的数量显著下降（P〈0．05）,6B型肺炎链球菌在免疫组与对照组小鼠鼻咽部及肺部均无显著差异（P〉0．05）;△A146Ply特异性抗血清△A146Ply蛋白对R6黏附A549细胞的抑制效应呈剂量依赖性。结论△A146Ply蛋白经黏膜免疫BALB／C小鼠可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著保护作用,为Ply作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的应用提供了实验依据。