肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S．pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S．pn菌株中的保守性。方法分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA。利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32（a）内,测序鉴定。将重组质粒转化到E．coli Rossetta（DE3）中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni—NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS—PAGE和Western印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达。纯化蛋白免疫BALB／C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。     

小鼠胚胎附植前后瘦素长型受体在下丘脑及消化器官的表达

目的对长型瘦素受体在雌性昆明鼠生殖周期中的表达情况进行研究。方法采用蛋白免疫印迹实验方法对下丘脑、胃、十二指肠组织中的瘦素受体进行了分析,并用免疫组织化学染色法对雌性KM鼠生殖周期不同阶段的下丘脑、胃、十二指肠组织中表达的瘦素长型受体进行定位分析。结果与结论瘦素受体六个亚型的分子量大约分别为(120、90、77、66.2、54、47)×103;下丘脑神经元胞质中有棕褐色阳性颗粒,且数目随妊娠日龄增加而增加;胃底腺中下部分胞质和细胞核有棕褐色阳性颗粒,且阳性率随妊娠日龄的增加而增加;十二指肠腺中胞质和细胞核有棕褐色阳性颗粒,且阳性率随妊娠日龄的增加而增加。     

肺炎链球菌溶血素黏膜免疫抗定植保护作用的研究

目的原核表达△A146Ply蛋白,评价△A146Ply黏膜免疫对肺炎链球菌（Streptococcuspneumon—ioe,5．Pn）在宿主鼻咽部定植的保护作用。方法IPTG诱导、Ni—NTA树脂纯化获得纯化的△A146Ply蛋白,经黏膜免疫BALB／C小鼠,制备其特异性抗血清;进行体内抗定植实验,观察小鼠鼻咽部灌洗液和肺部残存的细菌数量,检测△A146Ply黏膜免疫对19F型肺炎链球菌在鼻咽部定植的保护作用。为验证该保护作用是否具有广谱性,培养血清型14型、3型、6型和2型S．pn,经鼻腔感染免疫后小鼠,评价△A146Ply蛋白黏膜免疫对多株肺炎链球菌定植的保护作用。进行体外抗黏附实验,检测△A146Ply蛋白及其抗血清是否对无荚膜的肺炎链球菌R6黏附A549细胞具有抑制作用。结果获得了纯度〉90％的目的蛋白;体内实验结果显示,△A146Ply黏膜免疫可以显著降低肺炎链球菌19F在宿主鼻咽部和肺部残存的细菌数量（P〈0．01）;14型和3型肺炎链球菌在免疫后小鼠鼻咽部及肺部定植的数量均显著下降（P〈0．05）,2型肺炎链球菌在免疫后小鼠肺部定植的数量显著下降（P〈0．05）,6B型肺炎链球菌在免疫组与对照组小鼠鼻咽部及肺部均无显著差异（P〉0．05）;△A146Ply特异性抗血清△A146Ply蛋白对R6黏附A549细胞的抑制效应呈剂量依赖性。结论△A146Ply蛋白经黏膜免疫BALB／C小鼠可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著保护作用,为Ply作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的应用提供了实验依据。     

一种减毒肺炎链球菌溶血素突变体的构建与表达

目的使用重叠PCR方法构建构建△Al46Ply突变体,原核可溶性表达△Al46Ply蛋白,并明确其毒力变化情况;分析肺炎链球菌溶血素（pneumolysin,Ply）在不同血清型肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae,SPN）中的表达情况。方法以SPND39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体pry基因所需引物;利用重叠PCR方法扩增合成△Al46ply突变体。通过溶血实验分析其溶血活性,利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力,并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况。结果突变体基因测序结果显示,Plyl46位密码子GCT3个碱基被缺失,△Al46ply突变体构建成功,并实现了△Al46Ply的可溶性表达,得到纯度〉90％的重组蛋白。△A146Ply蛋白浓度为100000ng／ml亦未表现出溶血活性。△Al46Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性。Western印迹结果显示,△Al46Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应。结论△Al46Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子,可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体。     

金黄地鼠PrP基因组织特异性表达的研究

金黄地鼠是研究动物传染性海绵状脑病的理想模型动物之一,我们利用实时荧光定量RT-PCR技术,构建标准重组质粒制备标准曲线,对中枢神经系统的4个不同部位及外周6个组织提取总RNA,反转录后进行PrP基因表达的定量.结果发现,脑的四个检测部位都呈现高的表达量;在外周器官中,淋巴结的表达量和全脑相当,脾脏、心脏、肝脏和肺脏呈现中等程度的表达,肾脏的表达量最低.本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和不同组织在传染性海绵状病理发生中的作用,提供了基础数据.     

金黄地鼠PrP基因组织特异性表达的研究

金黄地鼠是研究动物传染性海绵状脑病的理想模型动物之一,我们利用实时荧光定量RT-PCR技术,构建标准重组质粒制备标准曲线,对中枢神经系统的4个不同部位及外周6个组织提取总RNA,反转录后进行PrP基因表达的定量.结果发现,脑的四个检测部位都呈现高的表达量;在外周器官中,淋巴结的表达量和全脑相当,脾脏、心脏、肝脏和肺脏呈现中等程度的表达,肾脏的表达量最低.本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和不同组织在传染性海绵状病理发生中的作用,提供了基础数据.     

粒细胞减少患者真菌感染的临床研究

真菌感染病例逐年增加,除了患者长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂以及肿瘤、艾滋病等致人免疫力低下是发生真菌感染的重要发病因素外,现在人们对中性粒细胞减少导致真菌感染的研究也越来越多,很多资料已将中性粒细胞的减少作为真菌感染的主要因素,尤其是在血液病患者、肿瘤患者的治疗过程中,应注意其粒细胞的变化,避免因此造成的真菌感染。为了解住院患者在粒细胞减少的情况下发生真菌感染的情况及其真菌种类,本研究对2002～2004年3年间发生的真菌感染病例进行调查,结果报告如下。     

肺炎链球菌假想的溶菌酶样蛋白的活性分析和鉴定

目的 探索肺炎链球菌中一种假想的溶菌酶样蛋白的活性.方法 生物信息学分析该基因的功能结构域;利用长臂同源PCR对该基因进行敲除,观察D39野生菌和缺陷菌在生物学性状的改变;利用底物PNP-（GIcNAc）和溶壁微球菌,构建过表达载体,绘制生长曲线,对截断和全长蛋白的溶菌酶活性进行鉴定.结果 生物信息学分析结果显示该基因的编码产物为β-1,4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶,属于糖基水解酶25家族;野生菌为长链生长,缺陷菌呈短链状;溶菌酶和假想的溶菌酶样蛋白均可使底物释放出游离的对硝基苯酚,A405nm吸光度值分别为1.166和0.792;同时也可使得溶壁微球菌发生溶解;含过表达质粒的肺炎链球菌较之野生菌,溶解较快.结论 假想的溶菌酶样蛋白具有溶菌酶活性,是一种新的溶菌酶.