产生炭疽杆菌抗原的一种新的限定培养基

<正>炭疽杆菌的三组分毒素是由三种多肽成份组成的一种复合毒素或毒性物质:水肿因子(EF;因子I)、保护性抗原(PA;因子Ⅱ)和致死因子(LF;因子Ⅲ)。没有     

炭疽杆菌的特性和主要毒力因子

炭疽是由炭疽杆菌芽胞引起的疾病,炭疽杆菌的主要毒力因子在毒力质粒上编码pXO1和pXO2,pXO1184.5kbp大小,编码分泌外毒素的基因,此二个外毒素为二亚单位毒素,二个A蛋白,致死因子（LF,83kD)和水肿因子（EF,89kD);一个B蛋白,保护因子（PA,85kD);分别由pXO1上的独立基因,Lef,Cya和Pag编码;pXO2为95.3kbp大小的小质粒,携带三个基因,CapB,CapC和CapA,与聚-γ-D谷氨酸构成的荚膜合成有关。     

炭疽毒素及其细胞受体的研究进展

炭疽毒素由 3种蛋白组成 :保护性抗原 (protectiveantigen ,PA)、致死因子 (lethalfactor,LF)和水肿因子 (edemafactor ,EF) .综述炭疽毒素研究的最新进展 .主要介绍炭疽毒素的关键致病因子———LF的结构与功能 ,炭疽毒素膜转运成分PA的结构及其受体 (anthraxtoxinreceptor ,ATR)和其cDNA克隆的结构 ,并讨论了在炭疽的治疗、预防和毒素在肿瘤治疗中的可能应用 .     

利用转基因小鼠筛选全人源炭疽致死因子中和抗体

炭疽是由炭疽芽孢杆菌引起的严重威胁人类健康的传染病。炭疽毒素包括3种蛋白质成分:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA与LF形成致死毒素(LT),与EF形成水肿毒素(ET)。由于致死毒素(LT)在感染者损伤及死亡中发挥主要作用,因此在炭疽感染晚期单纯使用抗生素治疗难以发挥疗效,治疗性中和抗体成为目前最有效的炭疽治疗药物。目前国外获得的炭疽毒素抗体多为炭疽PA抗体,美国FDA已批准瑞西巴库(人源PA单抗)用于吸入性炭疽的治疗。一旦炭疽芽孢杆菌被人为改构或PA中和表位发生突变,针对PA单一表位的抗体将可能失效,因此针对LF的抗体将成为炭疽治疗的有效补充。目前国外已有的LF抗体多为鼠源抗体和嵌合抗体,而全人源抗体可以避免鼠源抗体免疫原性高等缺点。本研究首先用LF抗原免疫人抗体转基因小鼠,利用流式细胞仪从小鼠脾淋巴细胞中分选抗原特异的记忆B细胞,通过单细胞PCR方法快速获得两株具有结合活性的抗LF单抗1D7和2B9。瞬时转染Expi 293F细胞制备抗体,通过毒素中和实验(TNA)发现1D7和2B9在细胞模型中均显示较好的中和活性,并且与PA单抗联合使用时,表现出较好的协同作用。总之,本文利用转基因小鼠、流式分选技术和单细胞PCR技术的优势,快速筛选到全人源LF抗体,为快速筛选全人源单克隆抗体开辟了新的思路与方法。     

重组炭疽水肿因子的表达与生物活性分析

炭疽毒素包括3种蛋白因子,即保护性抗原（PA）、致死因子（LF）和水肿因子（EF）。EF是钙调蛋白依耐的腺苷酸环化酶,可使细胞cAMP浓度升高,导致宿主防御能力下降。为深入研究炭疽毒素的作用机理,构建了原核表达质粒,在大肠杆菌中表达出重组EF（rEF）。经鉴定,rEF以可溶形式表达于细菌胞质中。经过金属螯和层析、阳离子交换层析和凝胶层析,每升诱导培养物可获得约5mg 重组蛋白。用重组蛋白免疫家兔获得了兔多抗,能够在细胞试验中中和rEF,体外细胞试验显示rEF具有很好的生物活性,在J774A.1和CHO细胞试验中,能与LF共同竞争和PA的结合位点,相互抑制。上述工作为深入研究炭疽毒素的作用机理,开发针对EF的毒素抑制剂打下基础     

炭疽杆菌的致病因子与炭疽的防治

炭疽为一种人、兽共患急性传染病,部分国家将炭疽杆菌作为生物威胁因子进行研究和生产。该菌毒性与质粒PXOl、PXO2有关,PXOl产物包括水肿因子、保护性抗原和致死因子。PXO2是另一编码致病因子,产物荚膜抑制细胞的吞噬,有助病菌繁殖、扩散和建立感染。抗生素与抗炭疽血清联合应用,突变保护性抗原、水肿因子、致死因子联合注射,Al(OH)3佐剂PA疫苗,减毒口服菌苗,PA基因重组活菌苗均可抵抗炭疽杆菌致死性攻击。     

炭疽毒素的细胞受体

炭疽杆菌外毒素是三组分蛋白质,构成两种毒素。水肿因子(EF)和致死因子(LF)分别是腺苷环化酶和金属蛋白酶,保护性抗原(PA)与细胞表面受体结合并将水肿因子或致死因子转移进细胞内发挥毒性作用。在哺乳动物细胞上己发现有两种受体,分别是肿瘤内皮标志8基因编码的细胞表面蛋白ATR／TEM8和毛细血管形态发生基因2编码的细胞表面蛋白CMG2。这两种受体蛋白的生理功能都不十分清楚,它们之间的氨基酸序列有很高的同源性(40％～60％)。氨基酸序列主要分信号肽、细胞外主基、跨膜区、脑浆尾四个区,细胞外主基内含von WIlle-brand因子A主基或称整合素插入主基(VWA／I主基),VWA／I主基内有金属离子依赖性粘连位点(MIDAS),是主基与PA蛋白质相互作用所必不可少的。这两种受体都有几种异构体,主要差异在于胞浆尾区的氨基酸长度不同。两种VWA／I主基都有封闭PA功能,阻止细胞中毒的作用,有望作为抗毒素治疗炭疽。     

改良炭疽菌苗开发中克隆的保护性效力和进展

<正>以往的研究致力于开发更安全、有效的人用炭疽菌苗,已经证明无论化学菌苗或活菌苗必须含有一种或几种毒素成份方可保护活芽胞攻击。我们近期的研究致力于∶畜苗炭疽杆菌Sterne株Aro_突变株,产保护性抗原(PA)的重组活菌苗,和含PA,PA片段和新佐剂配方的非活菌苗。 炭疽杆菌Aro—1和Aro—2 用四环素抗性转座子Tn916致突变,使炭疽杆菌链霉素抗体、产毒素、无荚膜株UM23—1产生两个独立的Aro~-突变株,此二株Aro~-突变株的生长需要几种芳香族复合物,命名为Aro—1、Aro~-—2,它们对小鼠和豚鼠比UM23—1株毒力弱,但用其免疫小鼠和豚鼠,对强毒炭疽杆菌芽胞致死量非肠道攻击提供明显保护。当体外无四环素培养时,两种Aro~-突变株回变到亲本表型。     

炭疽致死因子的结构域及功能

致死因子(lethal factor, LF)是一种能水解丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的金属蛋白酶,是炭疽毒素(toxin)的重要成分之一。炭疽LF由四个结构域组成:结构域Ⅰ主要负责与保护性抗原(protective antigen, PA)结合;结构域Ⅱ是主要功能区域;结构域Ⅲ具有高度可变性且能与底物特异性结合;结构域Ⅳ含有锌离子结合序列,发挥蛋白质的毒性作用。现就炭疽LF各个结构域的结构和功能,以及部分结构域中残基突变后对该蛋白质毒力的影响作一概述。     

应用改构的炭疽毒素作为靶向肿瘤细胞的药物递送系统及其效果评价

目的:通过改造炭疽毒素保护性抗原Protective Antigen (PA)及致死因子Lethal Factor (LF),尝试建立更加广谱的新型炭疽毒素靶向给药系统并对其递送效率进行定量评价.方法:采用基因工程手段,分别构建了3种改构的天然炭疽毒素保护性抗原PA及炭疽毒素的LF N端融合海肾荧光素酶(Luciferase)的LFn-linker-Luc的大肠杆菌重组表达体系.利用CCK-8法评价改构PA和LF共同作用肿瘤细胞后的细胞存活率;利用改构PA和LFn-linker-Luc与肿瘤细胞共孵育,通过测定细胞内荧光素酶活性,评价改构PA靶向肿瘤细胞的效果.结果:体外酶解实验证明构建的改构PA蛋白能够被正确地酶解成目的大小的片段;改构PA和LF共同作用肿瘤细胞能够显著降低细胞存活率;利用LFn-linker-Luc能够评价改构PA的靶向效率,PA蛋白的改构方式与其递送效率相关.结论:设计并改构的炭疽毒素药物递送系统,能够实现特异性靶向肿瘤细胞的效果,并具有更广谱的作用效果,为研制新型广谱抗肿瘤药物提供了新的思路和方法.     

炭疽杆菌毒素的可能的解毒药--多价抑制剂

ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 2 0 0 1年 19卷 10期 95 8～ 96 1页报道 :炭疽毒素是由炭疽杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ)产生的。在临床上 ,炭疽病是罕见的 ,但目前由于在生物战争和恐怖行为中有可能使用炭疽杆菌 ,因而引起科学家对炭疽病的日益增加的关注。如所周知 ,炭疽杆菌毒素是由保护抗原 (ＰＡ) ,即单一的受体结合部分 ,以及两种酶促部分 ,即水肿因子(ＥＦ)和致死因子 (ＬＦ) ,共同组成的。这 3种蛋白作为无毒的单体从炭疽杆菌体内释出后 ,就扩散到哺乳动物细胞表面的受体 ,并组配成为有毒的可结合于宿主细…     

蜡样杆菌是否产生炭疽毒素

据先期PNAS在线版报道,在一个幸存于吸入型炭疽肺炎综合症患体内分离到的蜡样杆菌中发现了编码炭疽毒素的质粒,这是首次在炭疽杆菌以外的自然微生物中发现完整炭疽质粒。     

炭疽水肿因子在大肠杆菌中高效表达及一步法纯化

【目的】本研究旨在建立一种简单快捷的炭疽水肿因子(EF)重组表达及纯化方法。【方法】构建GST-EF融合表达载体,基于EF基因的密码子使用偏好,选择菌株Escherichia coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL为表达宿主,对EF进行诱导表达;细胞透性技术分离粗蛋白,进而利用亲和层析一步法纯化EF;Native-PAGE、竞争性抑制实验及c AMP浓度分析用于鉴定EF的生物活性。【结果】实现了EF可溶性高效表达,透性化处理可有效抽提可溶性重组蛋白;利用亲和层析一步法纯化得到了纯度达96%的EF;EF可与保护性抗原(PA)结合形成水肿毒素,该毒素能够急剧提高CHO-K1细胞中c AMP的浓度。【结论】本研究建立了一种高效快速制备具有生物活性的炭疽水肿因子的方法,为炭疽相关研究工作提供了新的选择。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。     

揭开一种生物武器之谜

几年前有一个传说,在苏联出现了一种流行性致死性胸膜炎病症。这种致死病症是由痈引起的。实际上这种流行性病的病因是由于苏联的某个军事研究中心附近,不慎逸出了炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthraces)。正如人们所知,美国从事军事研究的科学家们最近发表文章,说明了这种致死性芽孢杆菌的作用方式。原来这种菌产生的恶性炭疽毒素是由三种蛋白质组成的:一种是保护性抗原(PA),第二     

重组炭疽致死因子的表达及生物活性分析

使用分泌型表达质粒,实现了重组炭疽致死因子(rLF)在大肠杆菌周质腔中的分泌表达。表达量约占菌体总蛋白的4％。经过离子交换和凝胶过滤纯化,每升诱导培养物可获得约3mg电泳纯的rLF。蛋白N端测序表明,rLF序列与天然炭疽LF一致。体外细胞毒性试验亦显示rLF具有很好的生物活性。rLF的成功表达为今后研究LF的作用机理、发展新型炭疽疫苗、筛选针对炭疽致死毒素的抑制剂打下基础。     

炭疽杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用基因重组技术获取炭疽杆菌保护性抗原(PA)。将炭疽杆菌保护性抗原编码基因pag与pET载体连接构建重组质粒,转化大肠杆菌DE3株,诱导表达炭疽杆菌保护性抗原,并经亲和层析及凝胶过滤纯化此抗原。实验成功构建了表达炭疽杆菌保护性抗原的重组菌株,纯化后PA纯度达90%,且经检测纯化产物具有天然PA的生物学活性。同时表明从大肠杆菌中纯化PA较以往从炭疽杆菌中获取PA简便易行。     

炭疽杆菌致死因子的克隆与表达

以炭疽杆菌A16R株基因组DNA为模板,PCR扩增出炭疽杆菌致死因子LF基因。构建pET-28(a)/LF表达质粒,并在大肠杆菌中表达。优化表达条件,可溶性目的蛋白表达量约占细菌可溶性总蛋白的10%,表达产物经疏水层析纯化后,目的蛋白约占90%。免疫双扩散及免疫印迹试验检测结果显示,该表达产物与炭疽杆菌诊断血清有特异性反应,具有抗原性。     

炭疽致死毒素中和试验检验标准

提出了一种毒素中和试验的操作细节标准。此实验室试验,测量含炭疽致死毒素抗体抗血清的特异性保护J774A．1细胞抗炭疽芽胞杆菌致死毒素的细胞毒性作用的能力,其比色试验建立在活细胞降解MTT的基础上,用炭疽吸附疫苗(AVA)制备的人和家兔抗血清验证这个试验结果。试验结果显示高水平的重复性和复现性,尤其是     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR-Fc是人炭疽毒素受体（ATR）的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3-1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA31/ATR9Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中,用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10～15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性,表明ATR-Fc可与PA特异性结合。