血管内皮生长因子基因3'UTR 不同基因型载体的构建与鉴定

目的:构建含SNP位点的血管内皮生长因子(VEGF)基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,为进一步揭示VEGF基因3’UTR的单核苷酸多态性(SNP)影响肺癌发病风险的分子机制奠定基础。方法:以rs3025039和rs3025040两个位点均为C纯合子的非癌症病人血液DNA为模板,扩增出两位点为C/C单体型、长度为1448 bp的VEGF基因3’UTR目的片段,测序验证后将其克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体上,得到重组质粒pMIR-C/C。同时,我们以pMIR-C/C为模板定点突变两个SNP位点,得到具有T/T单体型的重组质粒pMIR-T/T。将各重组质粒转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性克隆后提取质粒进行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:单菌落质粒测序验证显示带有C/C单体型的VEGF基因3’UTR重组质粒pMIR-C/C构建成功;经两次定点突变,成功将pMIR-C/C质粒转变为pMIR-T/T,经测序验证未引入任何其他突变。同时生物信息学预测还显示rs3025040位点位于miR-199a/b与VEGF基因mRNA的结合位置,其改变可以影响miRNA与mRNA的结合效率。结论:本研究成功构建了含有两个连锁SNP的VEGF基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,为今后VEGF基因3’UTR的功能研究奠定基础。     

SOX6 基因3'UTR 区野生型和突变型重组质粒的构建与鉴定

目的:构建含单核苷酸多态性(SNP)位点rs1065024的SOX6基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体,并用生物信息学软件预测与rs1065024位点区域相结合的mi RNA,为进一步研究此SNP位点的功能及mi RNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系奠定基础。方法:提取人全血基因组DNA,以基因组DNA为模板,通过PCR扩增含SNP位点在内的SOX6基因3'UTR片段,经过胶回收纯化后,将回收的目的片段插入双荧光素酶报告基因载体p MIR-REPORT中,再经DH5a转化扩增,挑单克隆进行菌落PCR并进行质粒提取,对质粒进行双酶切鉴定,最后进行DNA测序鉴定。针对SNP进行定点突变,构建出野生型和突变型重组质粒,并用生物信息学软件预测出与SNP位点相结合的mi RNA。结果:经单菌落质粒测序验证显示带有T碱基的SOX6基因3'UTR重组质粒p MIR-REPORT-3'UTR-T构建成功;经定点突变,成功将p MIR-REPORT-3'UTR-T质粒转变为p MIR-REPORT-3'UTR-C,经比对未引入任何其他突变;生物信息学预测显示,rs1065024位点位于mi R-190b、mi R-190a-5p、mi R-451b、mi R-4791与SOX6基因3'UTR的结合区域,其多态的改变可以影响mi RNA与m RNA的结合效率。结论:本研究成功构建了含SNP位点rs1065024的p MIR-REPORT-SOX6-3'UTR野生型和突变型重组质粒,为今后SOX6基因3'UTR的SNP位点的功能及mi RNA与SOX6基因3'UTR区之间的关系研究奠定基础。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

鸡gga-miR-7b靶基因VDAC1-3’UTR双荧光素酶报告基因质粒的构建

本研究以鸡gga-miR-7b作为研究对象,为了明确与肿瘤形成相关的关键基因VDAC1(Voltage-dependent anion channel 1)是否为gga-miR-7b的靶基因,深入研究gga-miR-7b对VDAC1基因的调控作用,本研究运用TargetScan和miRBD生物学软件预测了gga-miR-7b与VDAC1 m RNA的3’端非编码区(3’UTR)存在种子结合位点(GTCTTCC),并使用PCR克隆以及同源重组突变的方法构建VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒,经SacⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定及测序结果显示,片段大小符合且序列正确;成功构建了VDAC1-3’UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因重组质粒并命名为pmirGLOVDAC1-wt3’UTR和pmirGLO-VDAC1-mut3’UTR。本研究结果进一步为gga-miR-7b候选靶基因VDAC1的鉴定以及功能研究提供理论依据。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

含VEGF启动子的报告基因的构建及雌激素受体对其活性的影响

目的：构建含血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子的荧光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素受体作用下的转录活性。方法：以乳腺癌细胞系MCF-7基因组为模板,扩增VEGF启动子片段,克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的报告基因载体转染293T细胞,检测重组质粒中荧光素酶报告基因的表达。结果：酶切鉴定和DNA序列分析表明构建了正确的pGL3-basic—VEGF报告基因载体;转录活性实验表明构建的报告基因载体具有启动子活性,雌激素受体α（ERα）能以剂量依赖的方式升高VEGF启动子调控下的报告基因的转录。结论：克隆了VEGF启动子,为ERα共调节子的功能研究奠定了基础。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

IL28B基因多态性检测的质粒标准品构建

人类白介素28b（IL28b）的SNP位点rs12980275的多态性（AA、AG和GG）与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗的效果具有显著相关性。为了确保rs12980275预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果的价值,需要构建标准品作为rs12980275检测的标准对照。提取人类外周血基因组DNA,以IL28B SNP rs12980275为目的基因片段设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pGM-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并进行PCR、测序鉴定。结果 IL28B SNP rs12980275目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性与序列完整性。成功构建了IL28B基因SNP rs12980275突变检测的AA、AG和GG 3种质粒标准品,可作为预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果rs12980275突变检测的阳性质控物。     

IL-17A基因单核苷酸位点多态性与胃癌预后的相关性研究

探讨白介素17A基因多态性与胃癌预后的关系。129例研究对象纳入生存分析,分成死亡和存活两组,用基因测序的方法检测血液样本IL-17A基因SNP位点rs3748067、rs17880588基因型分布。rs3748067位点有3种基因型T/T、C/T、C/C,rs17880588位点有2种基因型A/G、G/G。比较存活组和死亡组之间的基因型分布频率和单点等位基因分布频率,发现rs3748067的基因型C/T在死亡组的分布频率较存活组高,基因型T/T和C/C在死亡组的分布频率低于存活组,两组之间分布频率差异有统计学意义(P0.05)。杂合型C/T基因型在存活组分布低于死亡组(OR=2.051,CI=0.016~1.420),该位点基因型杂合可能为胃癌预后的一种危险因素。rs17880588的两种基因型A/G、G/G在存活组和死亡组的分布频率差异无统计学意义(P0.05)。结论:IL-17A基因rs3748067位点SNP与胃癌预后可能有相关性。     

INCENP基因功能性单倍型可调控启动子活性并影响公牛精液品质

为研究内着丝粒蛋白(Inner centromere protein, INCENP)基因启动子区单核苷酸多态性(SNPs)与精液品质的相关性,本文利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测了250头中国荷斯坦公牛INCENP基因的基因型。在INCENP基因启动子区鉴定出两个SNPs (g.-556 G>T,rs 136823901和g.-692 C>T,rs 211010999),发现了3种单倍型(CG、TT、TG)。分析两个SNP位点的基因型频率和等位基因频率,各SNP及单倍型组合与中国荷斯坦公牛精液品质的相关性,结果表明SNP位点g.-556 G>T GT基因型个体的鲜精活力显著高于GG基因型个体(P<0.05),单倍型组合H1H1(CCGG)、H1H3(CTGT)、H2H3(TTGT)和H3H3(TTTT)个体的鲜精活力和冻精解冻后活力均显著高于H1H2个体(P<0.05)。为进一步研究g.-556 G>T和g.-692 C>T影响精液品质的可能机理,本文将3种单倍型质粒分别转染小鼠睾丸间质细胞(MLTC-1),结果显示含TG单倍型的载体荧光素酶活性最高。由此推测,g.-556 G>T和g.-692 C>T为启动子区功能性突变位点,可通过调节启动子活性来调控INCENP基因表达,进而影响精液品质。     

鸡IGFBP2基因3′UTR区1196C>A单核苷酸多态性的功能性鉴定及分析

鸡IGFBP2基因3′非编码区(3′UTR)1196CA单核苷酸多态性(SNP)与鸡的腹脂重和腹脂率显著相关.生物信息学分析显示,该SNP恰好位于gga-mi R-456-3p的一个潜在靶基因结合位点处,提示IGFBP2基因可能是gga-mi R-456-3p的一个靶基因,且该SNP位点可能影响gga-mi R-456-3p对IGFBP2基因表达的调控作用.为鉴定SNP 1196CA是否为功能性SNP,本研究分别构建了包含该SNP位点C或A等位基因的双荧光素酶报告基因载体,比较分析这两个等位基因在鸡胚成纤维细胞系(DF1)和鸡前脂肪细胞中对报告基因活性和表达的影响;利用mi RNA mimics和inhibitor分析gga-mi R-456-3p对不同等位基因报告基因活性以及内源性IGFBP2表达的影响.结果发现,在DF1细胞和鸡前脂肪细胞中,A等位基因的报告基因活性和表达均显著高于C等位基因(P0.05);gga-mi R-456-3p仅影响C等位基因的报告基因活性和表达,而对A等位基因的报告基因活性没有明显影响;gga-mi R-456-3p调控细胞内源性IGFBP2基因的m RNA和蛋白质表达.本研究证实IGFBP2基因是gga-mi R-456-3p的靶基因,其3′UTR区SNP 1196CA是一个功能性SNP,它影响gga-mi R-456-3p对鸡IGFBP2基因的表达调控作用.本研究结果对于鸡的分子辅助选择育种及IGFBP2基因在脂肪沉积中调控机制的阐明具有重要意义.     

白念珠菌FLO8基因突变株构建及鉴定

目的构建白念珠菌FLO8基因突变株。方法将白念珠菌FLO8基因插入pCP20质粒载体ADH1启动子之后,通过定向诱变获得FLO8基因R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变质粒载体,再通过同源重组技术将带有FLO8突变的基因片段整合至SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结果通过测序鉴定FLO8基因突变质粒载体构建成功;通过PCR验证表明突变FLO8基因整合到SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结论以pCP20质粒为载体,通过定向诱变、同源重组等技术,可以高效构建白念珠菌FLO8基因突变株。     

miR-126报告基因载体的构建及其功能鉴定

目的:根据miR-126的预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒,并进行功能鉴定。方法:利用sanger数据库提供的miR-126靶序列设计引物,PCR扩增目的微小RNA(microRNAs,miRNAs)靶基因3'非编码区(three-prime untranslated regions,3'UTRs)序列,PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的pGL3-control载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,进行阳性克隆鉴定。同样,将候选靶基因3'UTRs突变,突变型3'UTR克隆入pGL3-control报告载体,构建野生型和突变型的报告基因重组质粒。将野生型和突变型的报告基因载体分别和化学合成的microRNA以及内参质粒共转染293TN细胞,进行双荧光素酶检测。结果:成功构建miR-126报告基因野生型和突变型重组质粒pGL3-VEGF-A-3'UTR和pGL3-VEGF-A-3'UTR,质粒测序及酶切结果完全正确。瞬时转染实验显示,过表达miR-126能直接抑制VEGF-A-3'UTRs报告基因活性。结论:miR-126对VEGF-A具有靶向调节功能。     

部分扩增与双片段连接相结合制作长基因定点突变

重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒。以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒。两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性。该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案。     

中国老年心脑血管疾病患者阿司匹林抵抗与环氧化酶-1单体型关联分析

目的:旨在研究老年心脑血管病患者阿司匹林抵抗与阿司匹林作用靶点环氧化酶-1(COX-1)基因单体型的关联性。方法:入选北京地区服用阿司匹林的老年汉族心脑血管疾病患者431例,通过花生四烯酸诱导光比浊法,筛选出阿司匹林抵抗患者59例作为病例组,372例阿司匹林不抵抗者作为对照组,使用美国Sequenom系统SNP分型技术鉴定了COX-1基因6个常见单核苷酸多态性位点(SNP)与阿司匹林抵抗的关联性。6个SNP分别是:rs1888943(8759C/T)、rs1330344(1676A/G)、rs3842787(exon 2,50C/T,p.Pro17Leu)、rs5787(exon 4,323G/A,p.Arg108Gln)、rs5789(exon7,709C/A,p.Leu237Met)和rs5794(exon10,1330G/A,p.Val481Ile)。结果:突变COX-1单体型CGCGCC,在病例组频率为0.48(57/118),对照组频率为0.39(286/742),显著高于对照组(P≤0.05)。结论:中国老年汉族心脑血管疾病患者阿司匹林抵抗与COX-1单体型相关联,突变COX-1单体型CGCGCC显著增加了阿司匹林抵抗的发病风险。     

阿尔茨海默病中miR-29c对APP表达调控的初步研究

目的探讨microRNA29c（miR-29c）在阿尔茨海默病中的作用。方法采用了microarray芯片检测3月龄、6月龄APPswe/PSΔE9双转基因阿尔茨海默病小鼠大脑中microRNA表达情况并利用实时定量PCR验证结果可靠性,通过microRNA靶基因数据库预测选出与阿尔茨海默病相关的靶基因,构建miR-29c表达载体,将其转染SH-SY5Y及HEK-293T细胞,在高表达miR-29c的SH-SY5Y及HEK-293T细胞系中验证miR-29c对靶基因的调控作用。将靶基因APP mRNA的野生及突变3’UTR序列克隆到双荧光素酶报告基因载体,用双荧光素酶报告检测系统检测miR-29c与靶基因的结合位点。结果根据microRNA芯片结果筛选出在3、6月龄APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠大脑表达均有差异的miR-29c,通过实时定量PCR证实miR-29c在3月、6月、9月龄小鼠中表达明显升高。通过microRNA靶基因数据库预测miR-29c可以调控阿尔茨海默病的靶基因APP,利用Western blot检测到高表达miR-29c的SH-SY5Y细胞及HEK-293T细胞中APP蛋白表达减少。将miR-29c表达载体与带有野生及突变APPmRNA的3’UTR的双荧光素酶报告载体共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测未找到miR-29c与APP mRNA 3’UTR的结合位点。结论 miR-29c对APP表达的具有负向调控作用,但其调控位点可能不位于其3’UTR区域。     

BRAF和TP53基因热点突变的构建

目的:构建BRAF和TP53基因多个位点的点突变质粒,为进一步研究其在肿瘤形成中的作用奠定基础。方法:以HEK-293T基因组DNA为模板构建含BRAF600、TP53175和TP53248位点的野生型质粒,利用MutanBESTTM定点突变方法获得含BRAFV600E、TP53R175C和TP53R248W等突变位点的突变型质粒,并进行DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果显示构建的三个点突变与实验设计完全一致。结论:成功构建了BRAFV600E、TP53R175C和TP53R248W三个具有不同突变位点的突变型质粒,MutanBESTTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。     

人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。     

大鼠Cacnb1报告基因载体构建及miR-16靶向验证

子宫平滑肌过度收缩可导致原发性痛经。钙通道在子宫平滑肌收缩过程中起关键作用,钙通道电压依赖性β1蛋白(voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-1,CACNB1)是其主要组成部分。为探讨mi R-16在子宫平滑肌细胞收缩过程中的调控功能,需验证大鼠Cacnb1基因是否为mi R-16的靶基因。首先,设计特异性引物,扩增大鼠Cacnb1基因3′UTR序列,将扩增片段克隆到pmi R-RB-REPORTTM双荧光素酶报告基因载体,同时构建大鼠Cacnb1基因3′UTR突变的载体;随后,包含正常Cacnb1基因3′UTR序列的载体和突变后的载体分别与mi R-16 mimics共转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性变化。结果发现,mi R-16 mimics能够通过结合大鼠Cacnb1基因3′UTR序列显著抑制荧光素酶活性(n=3,P0.001),而对大鼠Cacnb1基因3′UTR突变后的荧光素酶活性无抑制作用。因此,mi R-16能够负向调控大鼠Cacnb1基因的表达,故大鼠Cacnb1基因是mi R-16的靶基因。     

CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响

CYP7A1（cholesterol 7α-hydroxylase ）在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达, 利用荧光素酶作为报告基因,将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3 basic质粒载体中,再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明,2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列,含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示,当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示,CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达,其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.