GABAA受体蛋白片段在大肠杆菌细胞表达条件研究*

为了提高GABAA受体a1蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了重组菌的发酵条件,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导培养时间和诱导剂IPTG使用浓度等对GABAA受体蛋白片段表达的影响。结果表明重组菌以LB培养基为发酵基质,按3％接种量,37℃培养细胞3.5h后IPTG 32℃诱导5h,菌体生物量为3.25g/L,目标蛋白表达量达95mg/L。用16L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达4.95g/L,发酵周期5.5h,最高目标蛋白表达量达到136mg/L.     

HCMV pp65截短蛋白原核表达条件优化

为了提高HCMVpp65蛋白片段在大肠杆菌中表达量,研究了不同发酵条件对其表达的影响,包括培养基、接种量、温度、摇床转速、pH、诱导时间以及诱导剂IPTG使用浓度等。结果表明,以LB培养基为发酵液,按5%接种量,37℃培养3h后IPTG诱导5h,重组菌菌体生物量为0.6g/L,目的蛋白表达量达18mg/L。用3.7L发酵罐进行放大培养,菌体生物量达0.85g/L,最高目的蛋白表达量达到25mg/L。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

不同培养条件对抗α毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和 0.4 mol/L蔗糖,37℃诱导6h,其目的蛋白的表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量为31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过E     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌发酵条件的优化

目的:优化嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)基因工程菌的发酵条件。方法:通过工程菌摇瓶培养、测定吸光度D值、凝胶灰度扫描分析表达量。结果:当起始pH值为7.0～7.2,以60/500mL的装液量、5%的接种量,于32℃培养3h,加入终浓度为0.2g/L的L-阿拉伯糖诱导6h后收获菌体,可得到较高的生物量和重组蛋白表达量。L-阿拉伯糖诱导开始时间和菌体收获时间对蛋白表达有显著影响。结论:为PyNPase结构研究和工业化生产奠定了基础。     

乳糖诱导的重组人血管内皮抑素(rhEndostatin)蛋白的表达

研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达,观察乳糖对乳糖操纵子调控的基因工程菌发酵及重组血管内皮抑素表达的影响,从而选取最佳诱导表达条件。以重组人血管内皮抑素表达工程菌pETrhEN/BL21(DE3)作为研究对象,分别用IPTG和乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。并对重组蛋白质表达量进行分析。然后在5 L发酵罐中进行验证。在摇瓶培养条件下,乳糖浓度大于0.5 g/L即可以诱导目的蛋白的表达。乳糖浓度1 g/L时诱导目的蛋白表达量与1 mmol/L的IPTG相当,当乳糖浓度为10 g/L,目的蛋白表达量达到最大。在发酵罐培养条件下,补料4 h后葡萄糖浓度基本耗尽,此时开始加入乳糖。诱导后1 h,即有重组蛋白表达,在诱导后4 h达到高峰(占菌体可溶性蛋白的56%),与此同时,诱导后5 h菌体浓度也达到最高值。在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导应在葡萄糖消耗完后进行。     

不同培养条件对抗a毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对SvFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue(pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和0.4mol/L蔗糖。37℃诱导6h,其目的蛋白 表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量在31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过ELISA法也检测到了ScFv的存在,且具有中和a毒素的活性。     

大肠杆菌发酵生产重组人源抗-HBs Fab

在KLF2000发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD/HBs Fab的TOP10大肠杆菌,生产人源抗-HBs Fab,为批量生产作准备,在发酵过程中,控制溶氧30%以上,温度37℃,在基础培养基内生长4h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到9h,加入阿拉伯糖,至终浓度为0.02%,30℃诱导表达5h,收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western blot方法检测Fab抗原性,Dot blot方法检测生物学活性。14h发酵结束后,菌体密度最终达96g/L,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的6%,含量为80mg/L,以重组质粒pBAD/HBs Fab,大肠杆菌TOP10表达表达比率与摇瓶相比没有降低,表达量达80mg/L左右,为大批量生产作了准备。     

重组人α降钙素基因相关肽在大肠杆菌中表达条件的优化

为提高人α降钙素基因相关肽(bαCGRP)在大肠杆菌中的表达量,研究了本室构建的pET-hαCGRP重组质粒在E.coli BL21trxB(DE3)pKysS宿主菌中的表达条件.经SDS-PAGE分析和YLN2000凝胶影像分析结果表明,重组菌以LB为培养基,氨苄青霉素浓度为50 mg/L,开始诱导时的菌体密度为OD600=0.6～0.8,所加IPTG的浓度为0.75mmol/L,37℃摇床180±5r/min振荡诱导培养4 h时,可获得高效表达的hαCGRP融合蛋白.重组蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的70%～80%;它主要以可溶性形式存在,为下一步纯化工作提供了方便.     

弧菌外膜蛋白ompk工程菌规模化培养表达初探

目的:为Ompk亚单位疫苗生产提供参数。方法:利用振荡和发酵培养,测定不同培养时间的菌液浊度和蛋白诱导表达效果。结果:工程菌30℃摇瓶培养10h,种子罐培养8～10h,较为合适;摇瓶和5L发酵罐诱导表达培养,升温42℃诱导表达,7h效果较佳;经5批次50L、500L发酵罐诱导表达培养,均可得到重组蛋白表达的工程菌体,50L和500L发酵罐最高生物量分别为5.32g/L和6.38g/L,平均可达到3.75 g/L和4.74 g/L;适当延迟升温诱导前的培养时间,可提高工程菌的得率。结论:初步确定了重组蛋白工程菌规模化诱导表达培养方法,利用500L发酵罐培养可得到诱导表达的工程菌体。     

基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpN Ecc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5% 的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L（WCW）,可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。     

大肠杆菌发酵生产重组人源抗

在KLF2000发酵罐中利用补料分批培养技术培养表达含重组质粒pBAD/HBs Fab的TOP10大肠杆菌,生产人源抗HBs Fab,为批量生产作准备。在发酵过程中,控制溶氧30%以上,温度37℃,在基础培养基内生长4 h后,补加以甘油为碳源的补料,继续生长到9 h,加入阿拉伯糖,至终浓度为002%,30℃诱导表达5h,收集菌体,纯化制备目的蛋白。利用Western blot方法检测Fab抗原性,Dot blot方法检测生物学活性。14h发酵结束后,菌体密度最终达96g/L,纯化所得蛋白大约占菌体总蛋白的6%,含量为80mg/L。以重组质粒pBAD/HBs Fab,大肠杆菌TOP10表达生产的人源抗HBs Fab为可溶性具生物学活性的蛋白,与包涵体表达相比避免了变性、复性这一复杂过程,发酵罐表达比率与摇瓶相比没有降低,表达量达80mg/L左右,为大批量生产作了准备。     

50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌

中试规模发酵重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）工程菌,并对表达产物进行纯化。摇瓶培养一级种子至合适密度,以10%比例接种二级种子培养基,在7L发酵罐中培养至OD600为9.6～10.5,然后转入80L发酵罐中进行补料分批培养,所得菌体裂解后,经离子交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品。结果表明,50L培养液经过10h培养后,湿菌收量为1560 g/批,NDPK-A表达量为23.8%。另外,补料方式对发酵密度有明显影响。与单纯补加碳源相比,同时补加碳源和氮源可以显著提高菌体产量,但对目的蛋白表达量地提高不明显。在较优条件下,菌体产量为(2220.00±169.71) g/批,蛋白表达量为(22.00±0.42) %,纯化后重组蛋白得率为510mg/L。产物可溶、密度适中、工艺简便的中试发酵条件的建立为高得率、大规模制备重组rhNDPK-A奠定了基础。     

重组大肠杆菌产尿素酶B高密度发酵条件的优化

探究重组大肠杆菌产尿素酶B（urease B subunit, UreB）的高密度发酵条件。通过实验室摇瓶和30 L发酵罐对UreB基因工程菌的发酵条件进行优化。结果表明：30 L发酵罐中以TB培养基为发酵培养基,接种量为5%,发酵温度为37 ℃,pH为6.8,溶氧量为30%左右,培养至2 h开始恒速流加50%甘油,4 h流加50%酵母提取物和50%胰蛋白胨,并加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG),诱导表达4 h,结束发酵,所得菌体干物质约为25.7 g/L,UreB表达量为31.4%。此工艺可以提高UreB的产量。     

累积番茄红素的大肠杆菌工程菌及其培养条件的研究

噬夏孢欧文氏菌番茄红素合成相关基因crtE, crtB, crtI同时克隆进表达载体pET-15b构建pET-15bcrtIEB,将该重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导工程菌累积红色色素,经HPLC和吸收光谱分析,工程菌中合成的色素为番茄红素。研究了碳源、金属离子、培养温度、诱导剂浓度、诱导时间等参数对工程菌生长及色素累积的影响,确定了合适的培养条件：培养基为改良LB培养基（蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、麦芽糖5g/L、MgCl2 0.1g/L,NaCl 10g/L）;起始培养温度为37℃;培养至OD600为0.6左右时加入IPTG,终浓度为0.5mmol/L,诱导温度降至30℃;诱导时间为14h。发酵完成后工程菌的生物量（干重）为3.45g/L,番茄红素的最高含量可达5.8mg/gDW。     

藻红蛋白的高效异源生物合成及其生物活性

[目的]实现藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成。[方法]将藻红蛋白生物合成的多个基因构建到单一表达质粒上,质粒转化大肠杆菌后获得表达菌株,优化诱导物、诱导温度和诱导时长等发酵条件,利用亲和层析法分离纯化重组藻红蛋白,分析重组蛋白的光谱学性质与抗氧化活性。[结果]获得了高效生物合成藻红蛋白的大肠杆菌菌株,以乳糖为诱导物时最佳诱导条件为:2.0 g/L的乳糖、25℃下诱导28 h,藻红蛋白表达量达211.6 mg/L;以IPTG为诱导物时最佳诱导条件为:0.4 mmol/L的IPTG,在25℃条件下诱导28 h,藻红蛋白表达量达188.7 mg/L。藻红蛋白色基结合率达92.0%,OD555/OD280为8.0。[结论]成功实现了藻红蛋白在大肠杆菌中的高效生物合成,重组藻红蛋白具有羟基自由基的清除活性。     

GST-SUMO-MT融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达

旨在考察在大肠杆菌中自诱导表达GST-SUMO-MT融合蛋白的可行性,并对自诱导培养条件及培养基成分进行优化,以提高蛋白产量。采用摇瓶培养,利用单因素和正交实验对工程菌自诱导的培养条件(诱导时间、诱导温度)和培养基组分(蛋白胨、酵母粉、甘油、葡萄糖、乳糖)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量。结果表明,自诱导培养基碳氮源的最优配比为:2%蛋白胨、2%酵母粉、0.3%甘油、0.05%葡萄糖和0.3%乳糖。重组菌自诱导表达最优发酵条件为:采用两阶段温度控制,37℃培养3 h,25℃继续培养13 h。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的2.2倍和2.3倍。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

重组人血小板生成素融合蛋白工程菌发酵工艺的研究

对表达重组人血小板生成素融合蛋白（rhTPO/GST)工程菌的发酵条件进行了较详细的研究,优化了影响工程菌发酵的条件,探讨了发酵条件对工程菌表达外源蛋白量的影响。结果发现采用复合培养基分阶段流加有机营养物,用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）进行诱导,使rhTPO/GST融合蛋白的湿菌重达25g/L以上,表达水平约占菌体总蛋白的30%左右。在此基础上,建立了中试发酵生产工艺流程。